Laboratorieskala Produksjon og rensing av et terapeutisk antistoff

Summary

Denne protokollen beskriver fremstillingen av et terapeutisk antistoff i et pattedyr ekspresjonssystem. Metodene som beskrives omfatter fremstilling av vektor-DNA, stabil transfeksjon og serumfritt tilpasning av en human embryonisk nyrecellelinje 293, setter opp av store kulturer og rensing ved hjelp av affinitetskromatografi.

Abstract

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

Introduction

Suksessen av terapeutiske antistoffer fortsetter å drive betydelig investering i antistoffutvikling som en bølge av neste generasjons therapeutics begynner. Antistoffet markedet forventes å bli omformet av antistoff-fragmenter ^1, antistoff-stoffet konjugater ^2, bispesifikke antistoffer ³ og utviklet antistoffer med gunstige egenskaper ^4. En annen klasse få farmasøytisk interesse er biosimilars. Biosimilar antistoffer er "svært lik 'replikere produkter av en terapeutisk antistoff som allerede har fått regulatorisk godkjenning. En foreslått biosimilar må være sammenlignbare med opphavs antistoff med hensyn til sin struktur, funksjon, dyr toksisitet, kliniske sikkerheten og effektiviteten, humane farmakokinetikk (PK), farmakodynamikken (PD) og immunogenisitet ^{5, 6.}

Godkjenningen rAtes av biosimilar antistoffer har vært treg på grunn av de strenge begrensninger på den endelige kvaliteten på produktet. De nøyaktige produksjonsprosesser som bestemt cellelinjer og dyrkingsforhold gjennom til den endelige behandlingstrinn kan forbli fortrolig. Hva mer er, produksjon av antistoffer i seg selv innebærer en grad av variasjon som kan legge til utfordringen med å produsere en svært lignende produkt. En omfattende fysio og biofysiske karakterisering og sammenligningen er ganske vanskelig, men en rekke studier som viser egenskapene til biosimilar antistoffer dukker opp i litteraturen ^{7, 8, 9.}

Generering av et terapeutisk antistoff begynner med transfeksjon av mammalske vertsceller med en vektor som bærer gener for de respektive antistoff. Vektor design, cellelinje og kultur forholdene er viktige hensyn for å sette opp expression system.

DNA-sekvenser av antistoffer kan være hentet fra Drug Bank (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) eller forskningspublikasjoner inkludert patenter. For eksempel sekvensen av trastuzumab er tilgjengelig gjennom Drug Bank (DB ID: DB00072). Aminosyresekvensen til de variable regionene kan gjennomgå genet utforming og optimalisering for syntese i de ønskede vertsart. Det er viktig for en biosimilar antistoff som ingen modifikasjon er laget for å aminosyresekvensen. Når syntetisert, kan antistoffgener blir subklonet inn i passende vektor for valg.

Humane IgG antistoffer består av to identiske tungkjeder og to identiske lette kjeder. Strengt regulert ekspresjon av begge kjedene er avgjørende for optimal produksjon av heterologe IgG-protein i pattedyrceller ^10. Intra- og inter-kjede-disulfidbindinger måtte bli dannet og en rekke post-translasjonelle modifikasjoner må være iinnført i løpet av proteinsyntese. En rekke vektorer er tilgjengelige som har blitt designet spesielt for å uttrykke antistoffgener (se tabell for material). Disse antistoff-spesifikke vektorer som vanligvis uttrykker de konstante områder for både tunge og lette kjeder slik at bare de variable områder i hver kjede krever kloning.

Transfeksjon av celler med to uavhengige konstrukter (co-transfeksjon) er den mest vanlige metode for tilførsel av tung og lett kjede-kodende gener. Det er, er hvert gen drives av sin egen promoter og transkribert som separate antistoffkjeder før de blir satt sammen i det endoplasmatiske retikulum. På den annen side, multi-cistronisk vektorer har interne ribosom innføringsstedet (IRES) elementer som inngår som tillater ekspresjon av multiple gener som et enkelt mRNA-transkript med oversettelse tillates fra interne regioner av mRNA ^11. I dette tilfelle blir de tunge og lette kjede-kodende gener koblet i en Arrangeement å oppnå co-uttrykk for begge antistoff kjedene ^{10, 12.}

Mens forbigående transfekterte celler, hvilket ga tilstrekkelig protein for å utføre et begrenset antall forsøk, kan stabilt transfekterte cellelinjer som har gjennomgått seleksjon for integrasjon genomet gir høyere utbytter. Høyere mengder protein tillate assay utvikling i forbindelse med in vitro karakterisering og kan gi en indikasjon av antistoff kvalitet i betraktning for nedstrøms applikasjoner som klonal cellelinje og bly kandidat valg.

Målet med denne artikkelen er å beskrive den stabile uttrykk og rensing av et terapeutisk antistoff produsert i en pattedyr uttrykk system. Faktisk kan denne metoden anvendes for ekspresjon av et biosimilar antistoff. Fremgangsmåten kan anvendes for den innledende karakterisering av antistoffer før fortsetter videre til den kritiske, enskjønt tidkrevende steps for å identifisere en ønskelig klone for større skala produksjon. Videre kan denne fremgangsmåte anvendes for å uttrykke andre proteiner og ikke bare antistoffer.

Den følgende detaljerte protokollen beskriver ekspresjon av terapeutiske antistoff trastuzumab. Denne består av fremstilling av vektor-DNA, etterfulgt av stabil transfeksjon i HEK-293 cellelinje og rensing av antistoff-protein ved en automatisert kromatografisk metode.

Protocol

MERK: En egnet pattedyr-ekspresjonsvektor som må brukes for denne protokollen. Her blir en enkel konstruksjon inneholdende to ekspresjonskassetter brukt (dvs. tung og lettkjede-ekspresjon drives av separate promotere). Trastuzumab tunge og lette kjeder ble tidligere klonet inn i vektoren. Denne vektoren var en gave fra Andrew Beavil, innhentet gjennom en ikke-for-profit plasmid depot 13. 1. Recovery og oppskalering av Vector DNA MERK: Vektor DNA ble mottatt som en myk agar…

Representative Results

Stabil produksjon av trastuzumab ved transfekterte HEK-293 celler ble bekreftet ved hjelp av bio-lag interferometri (BLI) som presentert i figur 1. En IgG standardkurve ble generert ved å måle bindingshastigheten mellom et IgG-antistoff standard og Protein A biosensor (figur 1A). Det urene supernatant Prøven ble på lignende måte målt, og dens konsentrasjon interpoleres fra standardkurven (figur 1B). Supernatanten konsentrasjonen bl…

Discussion

Denne protokollen beskriver transfeksjon stabil ekspresjon og rensing av et terapeutisk antistoff i HEK-293-celler. Stabil ekspresjon av antistoffgener er det første trinnet i å generere en antistoffproduserende cellelinje for utvikling og fremstilling av et terapeutisk antistoff. Mens kinesiske hamsterovarie (CHO) celler forblir uttrykket plattformen for terapeutiske proteiner, er HEK-293 cellelinje få prominence med realisering at proteiner som produseres i disse cellene er en tettere match til naturlig forekommend…

Materials

pFUSE vector series	N/A	InvivoGen	Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection.
mAbXpress vector series	N/A	ACYTE Biotech Pty Ltd.	Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
pVITRO1 vector	N/A	N/A	Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector.  Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
GS vector series	N/A	Lonza	Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript.
Multi-cistronic vector series 1	N/A	N/A	Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Multi-cistronic vector series 2	N/A	N/A	Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ	61883	Addgene	Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil.
Fast-Media Hygro Agar	fas-hg-s	Jomar Life Research	Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin.
Fast-Media Hygro TB	fas-hg-l	Jomar Life Research	Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin.
Glycerol, BioXtra, ≥99%	G6279	Sigma-Aldrich	Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature.
Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit	G221020	Astral Scientific	Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5).
FreeStyle 293-F Cells	R790-07	Life Technologies	HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media.
FreeStyle 293 Expression Medium	12338-018	Life Technologies	Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression.
Kolliphor P188	K4894	Sigma-Aldrich	Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4oC.
DMEM, high glucose	11995-065	Life Technologies
Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum	10082-147	Life Technologies
Polyethylenimine, Linear, MW 25,000	23966	Polysciences, Inc.	Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80oC until use.
OptiPro SFM	12309-050	Life Technologies	Transfection formulated serum-free media
Hygromycin B Solution	ant-hg-1	Jomar Life Research
Dimethylsulphoxide (DMSO)	AJA2225	Thermo Fisher Scientific
Tryptone (casein peptone)	LP0042B	Thermo Fisher Scientific	Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4oC.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml	09-2051-100	Astral Scientific
HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column	GE17-0403-01	Sigma-Aldrich
AKTApurifier 100	28406266	GE Healthcare	Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector.
Glycine-HCl	G2879	Sigma-Aldrich
Citric Acid, monohydrate	BIOC2123	Astral Scientific
Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate	BIOCB0035	Astral Scientific
1 M Tris-HCl solution pH 9.0	BIOSD8146	Astral Scientific
Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO)	UFC803008/UFC903008	Merck Millipore	Used to buffer exchange and concentrate purified protein.
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit	23227	Thermo Fisher Scientific
BLItz System	45-5000	fortéBIO	Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements.
Protein A biosensors	18-5010	fortéBIO
Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution	786-502	Astral Scientific
Ammonium Persulfate (APS)	AM0486	Astral Scientific
TEMED	AM0761	Astral Scientific
Coomassie Brilliant Blue R-250	786-498	Astral Scientific
Precision Plus Dual-Color Protein Standard	1610374	Bio-Rad