This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.
Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 °C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.
CFは、上皮陰イオンチャネルをコードする嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)遺伝子の変異によって引き起こされます。 CFは、全世界で約85,000人1に影響を与えます 。 2,000 CFTR変異が同定されている( www.genet.sickkids.on.ca )。この多様性は、部分的に観察された疾患表現型(広範囲の説明www.CFTR2.org )2、3。 CFTR突然変異の6つのクラスは、CFTRタンパク質の発現と機能に及ぼす影響に基づいて定義されている:(I)NO合成、(II)損なわれ、人身売買、(III)、不良チャネル開閉、(IV)変更されたコンダクタンス、通常の(V)減少したレベルCFTRの機能、および(VI)損なわれ、細胞表面安定4。臨床状態と共通のCFTR突然変異がよく研究されていますが、CFTR機能と関係poorl残りますyは特に希少な「孤児」変異(の大規模なグループのために、個々のレベルで理解www.CFTR2.org )1、3。
最近では、薬物は、突然変異特異的にCFTRタンパク質を標的と開発されています。 CFTRタンパク質を標的とする2つのクラスの薬物は、現在臨床で使用され、異なる作用様式を有します。このようなVX-770などの増強、頂端局在変異CFTRのオープン確率を高め、セル5への添加時に直接作用します。このようなVX-809のような補正器は、小胞体局在ミスフォールドCFTRの人身売買を復元し、効果は6観察される前に、細胞とのプレインキュベーションを必要とします。 CFTR増強、VX-770は、同様に他の8の場合と同様に、G551D変異7、8の被験者のために登録されていますCFTRは、S1251N 9を含む、変異をゲーティング。一緒に、これらの変異は、すべてのCF科目の5パーセントによって運ばれています。他の臨床試験では、VX-770、補正VX-809と組み合わせたが、肺機能にはまだかなりの影響を制限していることが示された患者10の百分の45から50によって運ばF508del突然変異についてホモ接合性の被験者における増悪率の減少を引き起こすしています11。
CF患者の残りの50%以内の薬物応答性被験体を同定するために、従来の臨床試験では、コストと時間がかかり、非常にまれなCFTR遺伝子型を持つ個人のために実行可能ではありません。小説、費用対効果の高い、パーソナライズされた方法は、CFTR突然変異のいずれかのタイプを運ぶ個人へのCFTRモジュレーターの増加数と一致することが重要です。今までは、特定のCFTR変異を有する患者群のトライアル含めることは、hでの変異CFTR遺伝子のトランスフェクションを用いた研究によって導かれていますチャンバー5、6、12をアッシングで電気生理学的研究に続いeterologous電池システム、。適切なCFの動物モデルの不足のために、CF肺の外植片の材料から誘導される空気-液体界面分化気管支上皮細胞における薬効研究は、薬物開発の13、14、15のために使用されています。しかし、肺の外植組織や侵襲的処置の限られた利用可能性はあまり一般的CFTR突然変異の分析を妨げる末期疾患のない被験者からの気管支細胞を取得し、パーソナライズされたファッションで薬物検査を防止することができます。これらの制限を克服するために、人工多能性幹細胞から誘導される大腸オルガノイド、鼻の気道細胞、および気道の細胞のような「簡単なアクセス」組織は、現在、パーソナライズされた薬物治療のために検討されています。
<p class= "jove_content">以前、我々は3Dオルガノイド16、17の形で任意の胃腸器官からの培養上皮幹細胞へのプロトコルを確立しました。ヒト結腸/直腸のために、培養条件は、小分子(ニコチンアミド、A83-01と組み合わせ定義された成長因子(上皮増殖因子(EGF)、ガストリンは、Wnt-3A、Rスポンジン3(Rspo3)、及びノギン)を含みます基底膜マトリックスおよびSB202190)。これらの条件下では、単一の幹細胞または小さな組織フラグメントは、閉じた、嚢胞性に外側に向い、その基端側で高い偏上皮によって形成された3D構造を成長させます。すべての細胞型は、典型的には、それらの正常な比率と位置で表示されます。オルガノイドは、毎週の機械的破壊と再メッキにより長期間にわたって拡張することができます。それらは、遺伝的および表現型的に安定であり、長期的な拡大、バイオバンキング17を可能にする、保存することができます。彼らはに適しています2Dセルライン18のために開発された全ての標準的な細胞生物学/遺伝子操作および分析技術。我々は最近、CFTRの機能を容易にフォルスコリン誘発性腫脹(FIS)アッセイ19、20に大腸オルガノイドで測定することができることを実証しました。コレラ毒素の代わりにフォルスコリン(FSK)や、にさらされたとき、オルガノイドは急速に、それらの環状アデノシン一リン酸(cAMP)のレベルを増加させるCFTRチャンネル19の開口部に回転もたらします。健康な個体から、または残存機能に関連したCFTR変異を有する被験者からのオルガノイドは、その後オルガノイドの内腔へのイオンと水輸送の結果、分泌性下痢のin vitroでの同等物として膨潤します。 CFTR-nullの個人由来オルガノイドによって示されるように大腸オルガノイドのFIS応答は以前に、完全にCFTR依存性であることが示されました特定の薬理学的CFTR阻害剤19を使用することによりND。大きな被写体固有のデータセットは、生検を取った後、数週間以内に導出することができます。
ここでは詳細に説明FISアッセイのために、オルガノイドは、どの年齢で及び限ら不快21を得ることができる直腸生検から培養されます。オルガノイドは、簡単に再密閉し、新しいオルガノイドを形成する単一の陰窩に機械的破壊によって毎週継代します。 FISアッセイを実行するために、これらの破砕少しオルガノイドの〜30-80は、96ウェルプレート19の各ウェルに播種します。アッセイの日に、オルガノイドをカルセイン緑、それがライブイメージングを容易にする、生きた細胞内に保持される蛍光細胞透過性色素で染色します。そして、細胞内cAMPを上昇させ、それによってCFTRを活性化するFSKは、オルガノイド膨潤を促進するために添加されます。頂端CFTRに作用増強を同時にワット追加されますフォルスコリンi番目、CFTRの人身売買を復元補正器に対し、FSKの添加前に24時間を追加されます。オルガノイド膨潤は、フォルスコリン添加時の各時点での全蛍光オブジェクトの合計面積の相対的増加を計算する自動画像解析によって定量化されます。
3Dオルガノイド腫れはアッシングチャンバーで2D培養気道細胞内の既存の電気生理学的CFTRの読み出しを超える利点と欠点を提供します。主な利点は、膨潤アッセイのスループットです。細胞を培養し、培養液の単一タイプを使用してアッセイであり、経験豊富な技術者は、12の患者サンプルで週当たり約1200のデータポイントを文化毎週25オルガノイドサンプルまで定量することができますしながら。私たちは、従来のプレートあたりの重複または三重測定により、単一の実験条件を入力して、三つの独立インキュベーション時点でそのような測定を繰り返します。合計で、約300〜500秒イングルオルガノイド構造は、次に限定された技術的な変動とCFTR機能の非常に正確な測定につながる実験条件、毎に測定されています。この精度は、私たちは明らかにCFTRモジュレーターに残存機能とレスポンスの違いを定義することができ、容易に同一のCFTR突然変異19、22、23、24、25を運ぶ患者間の遺伝的背景の影響をピックアップすることを可能にします。データの品質は、容易に顕微鏡画像から評価することができます。 FISは完全にCFTR依存性であるが、それはその読み出し流体輸送へのイオン輸送のカップリングによる、CFTR機能のための間接的なアウトカム指標です。これは、経上皮イオン電流26を測定アッシングチャンバーで直接CFTR機能の測定、とは対照的です。アッシングチャンバは、頂端または側底Cの選択刺激を可能にします(オルガノイドアッセイは許可されません)ompartments。側底膜を透過性にすることにより、頂端CFTR依存性アニオン分泌を選択的に27で測定することができます。
ここでは、ヒト結腸直腸オルガノイドの発生、拡大、凍結、融解のための完全なプロトコルを提供します。我々はいくつかの時間前に17人のオルガノイド培養を確立しているが、それは時々 、ハンズオントレーニングすることなく、他の研究室で技術の確立が困難であることが判明しました。私たちは、これらのプロトコルは、このような訓練を置き換えることを期待して?…
The authors have nothing to disclose.
この作品は、オランダCF財団(NCFS)、ZonMW(40-00812-98-14103)、ウィルヘルミナ小児病院研究基金とCZ、およびZilverenkruis / AchmeaのHIT-CFプログラムによってサポートされていました。我々はS. HEIDA・ミッシェル、M. Geerdink、KMデウィンター・ド・グルート、およびG. Berkers(小児呼吸器科、ウィルヘルミナこども病院、UMCユトレヒト)、及びRHJ Houwen(小児消化器科、ウィルヘルミナに感謝したいと思います患者に接近し、CFバイオバンクの生成のための生検を取得するための小児病院、UMCユトレヒト)。
Advanced Dulbecco’s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500ml | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #12634 | stored at 4 °C |
GlutaMax | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #35050 | stored at 4 °C |
Hepes | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | # 15630-056 | stored at 4 °C |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #15140-122 | stored at -20 °C |
96 well culture plate | Cellstar | #655180 | |
24 well culture plate | Cellstar | #662160 | |
6 well culture plate | Cellstar | #657160 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS) | Life Technologies: Gibco | #14190-094 | stored at 4 °C |
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM) 500ml | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #31966-021 | For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at 4 °C |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | #SFBS LOT#11113 | For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at -20 °C |
L Wnt3A cell line | ATCC | #CRL-2647 | For Wnt-3A Conditioend Medium Production. |
TOP/FOP plasmids | Millipore | #17-285 | For measuring Wnt activity |
pTK-Renilla | Promega | #E2241 | For measuring Wnt activity |
HEK-293 | ATCC | #CRL-1573 | For measuring Wnt activity |
Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | #E1910 | For measuring Wnt activity |
Zeocin | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #R250-01 | For Wnt-3A Cell line selection |
B27 supplement | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #17504-044 | stored at -20 °C |
N-Acetylcysteine | Sigma Aldrich | #A9165-5G | stored at -20 °C |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | #N0636 | stored at -20 °C |
Human Epithelial Growth Factor (hEGF) | PrepoTech | #AF-100-15 | stored at -20 °C |
Gastrin | Sigma Aldrich | #G9145 | stored at -20 °C |
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01) | Tocris | #2939 | stored at -20 °C |
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) | Selleckchem | #S1049 | stored at -20 °C |
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma Aldrich | #S7067 | stored at -20 °C |
Primocin | InvivoGen | #ant-pm-1 | stored at -20 °C |
Human Noggin (hNoggin) | PrepoTech | #120-10C | stored at -20 °C |
Human R-spondin 3 (hRspo-3) | R&D Systems | #3500-RS/CF | stored at -20 °C |
Vancomycin | Sigma Aldrich | #861987- 250mg | stored at -20 °C |
Gentamycin | Life Technologies: Gibco | #15710-049 | stored at -20 °C |
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | #431788 | Stored at 4 °C |
Matrigel | Corning | #354230 | stored at -80 °C |
TryplE Express | Life Technologies: Gibco | #12605-010 | for trypsinizing organoids for freezing |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies: Gibco | #12648010 | for freezing |
Calcein | Life Technologies: Gibco | #C3100MP | stored at -20 °C |
Forskolin | R&D Systems | #1099-50 mg | stored at -80 °C |
Lumacaftor (VX-809) | Selleckchem | #s1565 | stored at -80 °C |
Ivacaftor (VX-770) | Selleckchem | #s1144 | stored at -80 °C |
Name of Reagents/Material | Solvent | Stock Concentration | Final Concentration |
GlutaMax | 200 mM | 2m M | |
Hepes | 1 M | 10 mM | |
Penicillin/Streptomycin | 10K U/ml 10K µg/ml | 100 U/ml 100 µg/ml | |
Zeocin | 100 mg/ml | 125 µg/ml | |
B27 supplement | 100 x | 1 x | |
N-Acetylcysteine | MiliQ H20 | 500 mM | |
Nicotinamide | DPBS | 1 M | 10 mM |
Human Epithelial Growth Factor (hEGF) | DPBS 0.1%BSA | 0.5 mg/ml | 50 ng/ml |
Gastrin | DPBS | 100 µM | 10 nM |
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01) | DMSO | 5 mM | 500 nM |
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) | DMSO | 10 mM | 10 µM |
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | DMSO | 30 mM | 10 µM |
Primocin | 50 mg/ml | 100 µg/ml | |
Human Noggin (hNoggin) | DPBS 0.1%BSA | 100 µg/ml | 100 ng/ml |
Human R-spondin 3 (hRspo-3) | varies per lot | 300 ng/ml | |
Vancomycin | 10 mg/ml | 50 µg/ml | |
Gentamycin | 10 mg/ml | 50 µg/ml | |
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | MiliQ H20 | 0.5 M | 2 mM |
Calcein | DMSO | 10 µg/ml | 3.3 ng/ml |
Forskolin | DMSO | 10 mM | variable |
Lumacaftor (VX-809) | DMSO | 20 mM | variable |
Ivacaftor (VX-770) | DMSO | 20 mM | variable |