Forskolininducerad Svullnad i Intestinal Organoids: An<em> In Vitro</em> Analys av Läkemedels svar i patienter med cystisk fibros
Summary
This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.
Abstract
Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 °C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.
Introduction
CF orsakas av mutationer i cystisk fibros transmembran konduktans regulator (CFTR) -genen som kodar för en epitelial anjon kanal. CF påverkar cirka 85.000 människor över hela världen en. Över 2000 CFTR mutationer har identifierats ( www.genet.sickkids.on.ca ). Denna mångfald förklarar delvis ett brett spektrum av observerade fenotyper sjukdoms ( www.CFTR2.org ) 2, 3. Sex klasser av CFTR mutationer definieras baserat på deras effekt på CFTR proteinuttryck och funktion: (I) inte syntes, (II) nedsatt handel, (III) defekt kanal gating, (IV) förändrad konduktans, (V) minskade nivåer av normalt fungerande CFTR, och (VI) nedsatt cellytan stabilitet 4. Även om den gemensamma CFTR mutationer välstuderade, CFTR funktion och samband med klinisk status förblir poorly förstås på nivån för den enskilda, i synnerhet för den stora gruppen av sällsynta "föräldralösa" mutationer ( www.CFTR2.org ) 1, 3.
Nyligen har läkemedel utvecklats, vilka riktar sig mot CFTR-proteinet i en mutation-specifikt sätt. Två klasser av CFTR-proteinet inriktning läkemedel är för närvarande i klinisk användning och har olika verkningsmekanismer. Potentiatorer, såsom VX-770, förbättra den öppna sannolikheten för apikalt-lokaliserad mutant CFTR och agera direkt på deras Förutom celler 5. Korrektorer, såsom VX-809, återställa handel med endoplasmatiska nätverket lokaliserad felveckade CFTR och kräver pre-inkubation med celler innan effekter observeras 6. CFTR potentiator, VX-770, har registrerats för patienter med G551D-mutationen 7, 8, liksom för åtta andraCFTR gating mutationer, inklusive S1251N 9; tillsammans, är dessa mutationer som bärs av 5% av alla CF-patienter. Andra studier har visat att VX-770 i kombination med corrector VX-809, har begränsad ännu betydande påverkan på lungfunktionen och orsakar en minskning i exacerbationsgrad i ämnen homozygota för F508del mutation bärs av 45-50% av patienterna 10, 11.
Konventionella kliniska studier för att identifiera läkemedelskänsliga ämnen inom de återstående 50% av CF-patienter är kostsamma och tidskrävande och är inte möjligt för personer med extremt sällsynta CFTR genotyper. Roman, kostnadseffektiva, personlig metoder är avgörande för att matcha det ökande antalet CFTR modulatorer till individer som bär någon typ av CFTR mutation. Hittills har rättegången införandet av patientgrupper som bär specifika CFTR mutationer styrts av studier med muterade CFTR-genen transfektion i heterologous cellsystem, följt av elektrofysiologiska studier i Ussing-kamrarna 5, 6, 12. På grund av brist på lämpliga CF djurmodeller, läkemedelseffektstudier i luft-vätske gränssnitt-differentierade bronkiala epitelceller härledda från CF lung Explantation material har använts för läkemedelsutveckling 13, 14, 15. Men för att den begränsade tillgången på lung Explantation vävnader och ingrepp får luftrörs celler från patienter utan slutstadiet sjukdom hindrar analys av mindre vanliga CFTR mutationer och förhindra drogtestning i en personligt sätt. För att övervinna dessa begränsningar, "easy access" vävnader, såsom kolorektala organoids, nasala luftvägsceller, och luftvägsceller härledda från inducerade pluripotenta stamceller, är för närvarande på att undersökas för personligt anpassade läkemedelsbehandlingar.
<p class= "jove_content"> Tidigare har vi etablerat protokoll till kultur epitelceller stamceller från någon gastrointestinal organ i form av 3D organoids 16, 17. För human kolon / rektum, innebär odlingsbetingelserna definierade tillväxtfaktorerna (Epithelial tillväxtfaktor (EGF), gastrin, Wnt-3A, R-spondin 3 (Rspo3), och Noggin) i kombination med små molekyler (nikotinamid, A83-01, och SB202190) i en källare membranmatrisen. Under dessa betingelser, enkel stamceller eller små vävnadsfragment växa ut till slutna, cystisk, 3D-strukturer som bildas av högt polariserat epitel med dess basalsidan orienterad mot utsidan. Alla celltyper visas normalt i sina normala förhållanden och positioner. Organoids kan utökas över långa tidsperioder av vecko mekanisk sönderdelning och åter plätering. De är genetiskt och fenotypiskt stabila och kan lagras, vilket gör långsiktig expansion och bio-banking 17. De är mottagliga föralla vanliga cellbiologiska / genetiska manipulationer och analysmetoder som utvecklats för 2D-cellinjer 18.Vi visade nyligen att CFTR funktion lätt kan mätas i kolorektala organoids i en forskolin-inducerad svullnad (FIS) -analys 19, 20. När de utsätts för forskolin (FSK) eller, alternativt, till koleratoxin, organoids snabbt öka sin cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) nivåer, vilket i sin tur resulterar i öppnandet av CFTR kanal 19. Organoids från friska individer eller från patienter med CFTR mutationer som förknippas med kvarstående funktion, kommer därefter att svälla till följd av jon och vattentransport till organoid lumen, vilket motsvarar sekretorisk diarré in vitro. FIS svaret hos kolorektala organoids har tidigare visat sig vara fullt CFTR-beroende, såsom indikeras av organoids härledda från CFTR-null individer ennd genom användning av specifika farmakologiska CFTR-hämmare 19. Stora ämnesspecifika datamängder kan härledas inom flera veckor efter att ha tagit en biopsi.
För FIS-analysen beskrivs i detalj här, organoids odlas från rektala biopsier som kan erhållas i alla åldrar och med endast begränsad obehag 21. Organoids passeras varje vecka genom mekanisk störning i enstaka kryptor som lätt återförsluta och bildar nya organoids. För att köra FIS-analysen, ~ 30-80 av dessa sönderdelade små organoids stryks ut i varje brunn i en 96-brunnsplatta 19. Vid dagen för analysen, är organoids färgas med kalcein grönt, en fluorescerande cell-permeabel färgämne som den kvarhålles i levande celler, vilket underlättar levande avbildning. Sedan, FSK, vilket väcker intracellulär cAMP och därigenom aktiverar CFTR, tillsätts för att stimulera organoid svullnad. Potentiatorer som verkar på apikal CFTR tillsätts samtidigt wed forskolin, medan Korrektorer som åter CFTR trafficking tillsätts 24 timmar före tillsats av Fsk. Den organoid svullnad kvantifieras av en automatiserad bildanalys som beräknar den relativa ökningen av den totala arean av alla fluorescerande objekt för varje tidpunkt på forskolin tillägg.
3D organoida svullnad ger fördelar och nackdelar jämfört med existerande elektro CFTR avläsning i 2D odlade luftvägsceller i Ussing kammare. En stor fördel är genomströmningen av svällt analysen. Cellerna odlas och analyseras med hjälp av en enda typ av odlingsmedium, och en erfaren tekniker kan kulturen upp till 25 organoid prover på veckobasis medan kvantifiera ca 1200 datapunkter per vecka i 12 patientprover. Vi skriver konventionellt en enda försöks tillstånd genom dubbla eller tredubbla mätningar per platta och upprepa sådana mätningar vid tre oberoende inkubation tidpunkter. Totalt, cirka 300-500 sIngle organoid strukturer mäts sedan per experimentell tillstånd, vilket leder till mycket exakta mätningar av CFTR-funktion med begränsad teknisk variabilitet. Denna precision ger oss möjlighet att tydligt definiera skillnader i restfunktion och svar på CFTR modulatorer och tillåter oss att enkelt plocka upp genetiska bakgrundseffekter mellan patienter som bär identiska CFTR-mutationer 19, 22, 23, 24, 25. Datakvalitet kan enkelt bedömas från mikroskopbilder. Medan FIS är helt CFTR beroende, är det en indirekt effektmåttet för CFTR-funktion, dess utläsning orsakas av koppling av jontransport till vätsketransport. Detta kan jämföras med direkta CFTR funktionsmätningar i Ussing-kammare, som mäter transepitelial jonströmmar 26. Ussing-kammare tillåter väljer stimulering av apikal eller basolateral compartments (som organoid analysen inte tillåter); genom permeabilisering basolaterala membran, kan den apikala CFTR beroende anjon sekre selektivt mätas 27.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här ger vi en komplett protokoll för generering, expansion, frysning och upptining av humana kolorektala organoids. Även om vi har etablerat mänskliga organoid kulturer för en tid sedan 17, har det ibland varit svårt att etablera tekniken på andra labb utan praktisk utbildning. Vi räknar med att dessa protokoll kommer att ersätta sådan utbildning.
Wnt-3A-konditionerat medium är en av de mest avgörande reagens för att lyckas etablera och upprätthålla en …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av HIT-CF program i den holländska CF foundation (NCFS), ZonMW (40-00812-98-14103), Wilhelmina Barnsjukhus Research Fund och CZ, och Zilverenkruis / Achmea. Vi vill tacka S. Heida-Michel, M. Geerdink, KM de Winter-de Groot, och G. Berkers (Institutionen för Pediatric Pulmonology, Wilhelmina Barnsjukhus, UMC Utrecht), och RHJ Houwen (Institutionen för Pediatric Gastroenterology, Wilhelmina Barnsjukhus, UMC Utrecht) för att närma patienterna och få biopsier för generering av en CF Biobank.
Materials
| Advanced Dulbecco’s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500ml | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #12634 | stored at 4 °C |
| GlutaMax | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #35050 | stored at 4 °C |
| Hepes | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | # 15630-056 | stored at 4 °C |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #15140-122 | stored at -20 °C |
| 96 well culture plate | Cellstar | #655180 | |
| 24 well culture plate | Cellstar | #662160 | |
| 6 well culture plate | Cellstar | #657160 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS) | Life Technologies: Gibco | #14190-094 | stored at 4 °C |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM) 500ml | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #31966-021 | For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | #SFBS LOT#11113 | For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at -20 °C |
| L Wnt3A cell line | ATCC | #CRL-2647 | For Wnt-3A Conditioend Medium Production. |
| TOP/FOP plasmids | Millipore | #17-285 | For measuring Wnt activity |
| pTK-Renilla | Promega | #E2241 | For measuring Wnt activity |
| HEK-293 | ATCC | #CRL-1573 | For measuring Wnt activity |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | #E1910 | For measuring Wnt activity |
| Zeocin | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #R250-01 | For Wnt-3A Cell line selection |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #17504-044 | stored at -20 °C |
| N-Acetylcysteine | Sigma Aldrich | #A9165-5G | stored at -20 °C |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | #N0636 | stored at -20 °C |
| Human Epithelial Growth Factor (hEGF) | PrepoTech | #AF-100-15 | stored at -20 °C |
| Gastrin | Sigma Aldrich | #G9145 | stored at -20 °C |
| TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01) | Tocris | #2939 | stored at -20 °C |
| Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) | Selleckchem | #S1049 | stored at -20 °C |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma Aldrich | #S7067 | stored at -20 °C |
| Primocin | InvivoGen | #ant-pm-1 | stored at -20 °C |
| Human Noggin (hNoggin) | PrepoTech | #120-10C | stored at -20 °C |
| Human R-spondin 3 (hRspo-3) | R&D Systems | #3500-RS/CF | stored at -20 °C |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | #861987- 250mg | stored at -20 °C |
| Gentamycin | Life Technologies: Gibco | #15710-049 | stored at -20 °C |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | #431788 | Stored at 4 °C |
| Matrigel | Corning | #354230 | stored at -80 °C |
| TryplE Express | Life Technologies: Gibco | #12605-010 | for trypsinizing organoids for freezing |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies: Gibco | #12648010 | for freezing |
| Calcein | Life Technologies: Gibco | #C3100MP | stored at -20 °C |
| Forskolin | R&D Systems | #1099-50 mg | stored at -80 °C |
| Lumacaftor (VX-809) | Selleckchem | #s1565 | stored at -80 °C |
| Ivacaftor (VX-770) | Selleckchem | #s1144 | stored at -80 °C |
| Name of Reagents/Material | Solvent | Stock Concentration | Final Concentration |
| GlutaMax | 200 mM | 2m M | |
| Hepes | 1 M | 10 mM | |
| Penicillin/Streptomycin | 10K U/ml 10K µg/ml | 100 U/ml 100 µg/ml | |
| Zeocin | 100 mg/ml | 125 µg/ml | |
| B27 supplement | 100 x | 1 x | |
| N-Acetylcysteine | MiliQ H20 | 500 mM | |
| Nicotinamide | DPBS | 1 M | 10 mM |
| Human Epithelial Growth Factor (hEGF) | DPBS 0.1%BSA | 0.5 mg/ml | 50 ng/ml |
| Gastrin | DPBS | 100 µM | 10 nM |
| TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01) | DMSO | 5 mM | 500 nM |
| Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) | DMSO | 10 mM | 10 µM |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | DMSO | 30 mM | 10 µM |
| Primocin | 50 mg/ml | 100 µg/ml | |
| Human Noggin (hNoggin) | DPBS 0.1%BSA | 100 µg/ml | 100 ng/ml |
| Human R-spondin 3 (hRspo-3) | varies per lot | 300 ng/ml | |
| Vancomycin | 10 mg/ml | 50 µg/ml | |
| Gentamycin | 10 mg/ml | 50 µg/ml | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | MiliQ H20 | 0.5 M | 2 mM |
| Calcein | DMSO | 10 µg/ml | 3.3 ng/ml |
| Forskolin | DMSO | 10 mM | variable |
| Lumacaftor (VX-809) | DMSO | 20 mM | variable |
| Ivacaftor (VX-770) | DMSO | 20 mM | variable |
References
- De Boeck, K., Amaral, M. D. Progress in therapies for cystic fibrosis. Lancet Respir Med. 4 (8), 662-674 (2016).
- Cutting, G. R. Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application. Nature Rev Genet. 16 (1), 45-56 (2015).
- Sosnay, P. R., Siklosi, K. R., et al. Defining the disease liability of variants in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene. Nature Genet. 45 (10), 1160-1167 (2013).
- Zielenski, J. Genotype and phenotype in cystic fibrosis. Respiration. 67 (2), 117-133 (2000).
- Van Goor, F., Hadida, S., et al. Rescue of CF airway epithelial cell function in vitro by a CFTR potentiator, VX-770. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 106 (44), 18825-18830 (2009).
- Van Goor, F., Hadida, S., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 108 (46), 18843-18848 (2011).
- Accurso, F. J., Rowe, S. M., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).
- Ramsey, B. W., Davies, J., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
- De Boeck, K., Munck, A., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).
- Boyle, M. P., Bell, S. C., et al. A CFTR corrector (lumacaftor) and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 2 (7), 527-538 (2014).
- Wainwright, C. E., Elborn, J. S., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).
- Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B. J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. J Cyst Fibros. 13 (1), 29-36 (2014).
- Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods Mol Biol. 741, 39-54 (2011).
- Randell, S. H., Fulcher, M. L., O’Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
- Karp, P. H., Moninger, T. O., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods Mol Biol. 188, 115-137 (2002).
- Sato, T., Vries, R. G., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., Stange, D. E., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Clevers, H. Modeling development and disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Dekkers, J. F., Wiegerinck, C. L., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Med. 19 (7), 939-945 (2013).
- Dekkers, J. F., van der Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1 (1), e27112 (2014).
- Servidoni, M. F., Sousa, M., et al. Rectal forceps biopsy procedure in cystic fibrosis: technical aspects and patients perspective for clinical trials feasibility. BMC gastroenterology. 13, 91 (2013).
- Ommen, D. D. Z. -. V., Vijftigschild, L. A. W., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. 15 (2), 158-162 (2016).
- Dekkers, J. F., Gogorza Gondra, R. A., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. , (2016).
- Dekkers, J. F., Van Mourik, P., et al. Potentiator synergy in rectal organoids carrying S1251N, G551D, or F508del CFTR mutations. J Cyst Fibros. , (2016).
- Dekkers, J. F., Berkers, G., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Sci Transl Med. 8 (344), 344ra84 (2016).
- Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. J Cyst Fibros. 3, 123-126 (2004).
- Sheppard, D. N., Carson, M. R., Ostedgaard, L. S., Denning, G. M., Welsh, M. J. Expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in a model epithelium. Am J Physiol. 266 (4 Pt 1), L405-L413 (1994).
- Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H. Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells. Gastroenterology. 143 (6), 1518-1529 (2012).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
- Vijftigschild, L. A. W., Berkers, G., et al. β2-adrenergic receptor agonists activate CFTR in organoids and subjects with cystic fibrosis. Eur Respir J. 48 (3), 768-779 (2016).
- Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR in human plasma. J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).
- Graeber, S. Y., et al. Intestinal Current Measurements Detect Activation of Mutant CFTR in Patients with Cystic Fibrosis with the G551D Mutation Treated with Ivacaftor. Am J Respir Crit Care Med. 192 (10), 1252-1255 (2015).
- Van Goor, F., et al. Ivacaftor potentiation of multiple CFTR channels with gating mutations. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the Eur Cyst Fibrosis. 11 (3), 237-245 (2012).
