Inchaço na Organóides intestinal induzida por forscolina: An<em> In Vitro</em> Ensaio para a Avaliação de Medicamentos Response na Fibrose Cística Os pacientes

Summary

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Abstract

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 °C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Introduction

FC é causada por mutações no gene da fibrose cística regulador da condutância transmembranar (CFTR), que codifica um canal de anião epitelial. CF afeta cerca de 85.000 pessoas em todo o mundo ^1. Mais de 2.000 mutações CFTR foram identificados ( www.genet.sickkids.on.ca ). Esta diversidade explica parcialmente um amplo espectro de fenótipos da doença observados ( www.CFTR2.org ) ^{2, 3.} Seis classes de mutações CFTR são definidos com base no seu efeito na expressão da proteína de CFTR e função de: (i) nenhuma síntese, (II) tráfico prejudicada, (III) gating canal defeituoso, (IV) condutância alterada, (v) níveis de normalmente reduzida CFTR funcional, e (VI) a estabilidade da superfície de células deficientes ^4. Embora as mutações CFTR comuns são bem estudadas, a função de CFTR e sua relação com o estado clínico permanecem poorlY compreendido no nível do indivíduo, em particular para a grande grupo de "órfãos" mutações raras ( www.CFTR2.org ) ^{1, 3.}

Recentemente, as drogas que têm sido desenvolvidos como alvo a proteína CFTR de um modo específico da mutação. Duas classes de CFTR drogas-alvo proteínas estão atualmente em uso clínico e têm modos distintos de ação. Potenciadores, tais como VX-770, aumentar a probabilidade, aberto de CFTR mutante apical-localizados e agir diretamente sobre sua adição às células ^5. Correctores, tais como VX-809, restaurar o tráfico de endoplasmático CFTR misfolded localizada-retículo e exigem pré-incubação com células antes que os efeitos são observados ^6. O potenciador CFTR, VX-770, foi registrado para indivíduos com a mutação G551D ^{7, 8,} bem como para outros oitoCFTR gating mutações, incluindo S1251N ^9; em conjunto, estas mutações são realizados por 5% de todos os pacientes com FC. Outros estudos clínicos indicaram que VX-770, combinado com o corrector de VX-809, tem limitado ainda efeitos significativos sobre a função pulmonar e provoca uma diminuição nas taxas de exacerbação em indivíduos homozigóticos para a mutação F508del transportadas por 45-50% dos pacientes ^{10, 11.}

ensaios clínicos convencionais para identificar temas de droga-responsivo dentro os restantes 50% de pacientes com FC são dispendiosos e consumidores de tempo e não são viáveis ​​para os indivíduos com genótipos CFTR extremamente raros. Novel,, métodos personalizados de baixo custo são cruciais para coincidir com o número crescente de moduladores de CFTR aos indivíduos portadores de qualquer tipo de mutação CFTR. Até agora, a inclusão julgamento de grupos de pacientes portadores de mutações CFTR específicas tem sido orientada por estudos utilizando mutante transfecção gene CFTR em hsistemas de células de eterologous, seguidos por estudos eletrofisiológicos em câmaras de Ussing ^{5, 6, 12.} Devido a uma falta de modelos animais adequados, CF estudos de eficácia de drogas em células epiteliais brônquicas ar-líquido da interface diferenciadas derivadas de materiais de explante pulmonar FQ têm sido utilizados para o desenvolvimento de fármacos ^{13, 14, 15.} No entanto, a disponibilidade limitada de tecidos de explantes pulmonares e os procedimentos invasivos para obter células brônquicas de indivíduos sem a doença em fase terminal dificultar a análise de mutações CFTR menos comuns e impedir que o teste de drogas de forma personalizada. Para superar essas limitações, tecidos "fácil acesso", como Organóides colorretais, células das vias aéreas nasais e células das vias respiratórias derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas, estão actualmente a ser exploradas para tratamentos com medicamentos personalizados.

<p class= "jove_content"> Anteriormente, estabelecemos protocolos para a cultura de células estaminais epiteliais de qualquer órgão gastrointestinal na forma de 3D Organóides ^{16, 17.} factores de crescimento para o cólon / recto humana, definidos envolvem as condições de cultura (Factor de Crescimento Epitelial (EGF), gastrina, Wnt-3A, R-espondina 3 (Rspo3), e Noggin) combinado com pequenas moléculas (nicotinamida, A83-01, e SB202190) numa matriz de membrana basal. Sob estas condições, as células estaminais individuais ou pequenos fragmentos de tecido crescer até formarem cística, estruturas 3D fechado formado por epitélio altamente polarizada com o lado basal orientada para o exterior. Todos os tipos de células normalmente aparecem em suas proporções normais e posições. Organóides pode ser expandida ao longo de períodos longos por ruptura mecânica semanal e re-plaqueamento. Eles são geneticamente e fenotipicamente estáveis e podem ser armazenados, permitindo a expansão de longo prazo e bio-banking ^17. Eles são passíveis detodas as manipulações de células-biológico padrão / genéticos e técnicas de análise desenvolvido para linhas celulares 2D ^18.

Recentemente, demonstramos que a função CFTR pode ser facilmente medido em Organóides colorretais em um ensaio de edema induzido por forscolina (FIS) ^{19, 20.} Quando exposto a forscolina (FSK) ou, alternativamente, a toxina da cólera, Organóides aumentar rapidamente a sua monofosfato de adenosina cíclico níveis (cAMP), que por sua vez, resulta na abertura do canal CFTR ^19. Organóides de indivíduos saudáveis, ou a partir de indivíduos com mutações de CFTR associado com função residual, vai inchar subsequentemente como uma consequência de iões e de transporte de água para o lúmen, organ�de o equivalente in vitro de diarreia secretora. A resposta de FIS Organóides colorrectais foi mostrado previamente para ser totalmente CFTR-dependente, tal como indicado por Organóides derivadas de indivíduos CFTR-null, umnd pela utilização de inibidores de CFTR farmacológicas específicas ^19. Grandes conjuntos de dados específicos de um assunto pode ser derivada dentro de várias semanas depois de tomar uma biópsia.

Para o ensaio de FIS descrito em detalhe aqui, Organóides são cultivadas a partir de biópsias rectais que podem ser obtidos em qualquer idade e com apenas desconforto limitada ^21. Organóides são passadas semanalmente por perturbação mecânica em criptas de solteiro que facilmente fechado hermético e formar novos Organóides. Para a execução do ensaio de FIS, ~ 30-80 destes Organóides pequenos rompidas foram semeadas em cada poço de uma placa de 96 poços ^19. No dia do ensaio, as Organóides são coradas com verde calceína, um corante fluorescente de células-permeável que é mantido dentro de células vivas, facilitando imagens ao vivo. Em seguida, Fsk, o que aumenta o AMPc intracelular e deste modo activa CFTR, é adicionado a fim de estimular o inchaço organ�de. Potenciadores que atuam sobre CFTR apical são adicionados simultaneamente wom o forskolin, enquanto corretores que restauram tráfico CFTR são adicionados 24 horas antes da adição de Fsk. O inchaço organ�de é quantificada pela análise de imagem automatizado que calcula o aumento relativo da área total de todos os objectos fluorescentes para cada ponto de tempo após a adição de forscolina.

3D organ�de inchaço oferece vantagens e desvantagens sobre leituras CFTR eletrofisiológicos existentes nas células das vias aéreas cultivadas em 2D em Ussing câmaras. Uma grande vantagem é a capacidade do ensaio de inchamento. As células são cultivadas e analisadas utilizando um único tipo de meio de cultura, e um técnico experiente pode cultura até 25 amostras organ�de numa base semanal, enquanto quantificando cerca de 1.200 pontos de dados por semana em 12 amostras de pacientes. Nós convencionalmente digitar uma única condição experimental por meio de medições em duplicado ou triplicado por placa e repetir tais medições em três momentos de incubação independentes. No total, cerca de 300-500 single organ�de estruturas são então medidos por condição experimental, o que leva a medições muito precisas da função CFTR com variabilidade técnica limitada. Esta precisão permite-nos definir claramente diferenças na função residual e resposta para moduladores de CFTR e nos permite escolher facilmente se os efeitos genéticos fundo entre os pacientes portadores de mutações CFTR idênticos ^{19, 22, 23, 24, 25.} A qualidade dos dados pode ser facilmente avaliada a partir de imagens de microscópio. Enquanto FIS é totalmente CFTR-dependente, é uma medida de resultado indirecto para a função CFTR, o seu fora de leitura causada pelo acoplamento de transporte de íons para o transporte de fluidos. Isto contrasta com medições da função CFTR diretos em câmaras Ussing, que medem transepiteliais correntes iônicas ^26. câmaras de Ussing permitir a estimulação seleccionado de apical ou basolateral Compartments (que o ensaio organ�de não permite); por permeabilização de membranas basolaterais, a secreção dependente de anião CFTR apical pode ser medido selectivamente ^27.

Protocol

Todos os experimentos usando tecidos humanos aqui descritos foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade Medical Center Utrecht (UMCU; TcBio # 14-008). O consentimento informado para a recolha de tecidos, geração, armazenamento e uso dos Organóides foram obtidas junto aos pacientes do Hospital (WKZ) -UMCU de Wilhelmina Children. Equipamento consumível <…

Representative Results

A Figura 1A mostra um isolamento fresco representante da criptas incorporados em BMM. As criptas são a partir de uma biópsia de um sujeito colorrectal CF. Normalmente, um organ�de é gerado a partir de cada cripta (Figura 1A – C). Devido à disfunção da CFTR, a maioria dos Organóides cólon CF não são cística, mas sim são compactos e com projecções e brotos (Figura 2A – 2B). No entanto, a…

Discussion

Aqui, nós fornecemos um protocolo completo para a geração, a expansão, o congelamento e descongelamento das Organóides colorectal humanos. Enquanto nós estabelecemos culturas organ�de humanos há algum tempo atrás ^17, tem por vezes sido difícil para estabelecer a tecnologia em outros laboratórios, sem treinamento prático. Prevemos que esses protocolos irá substituir essa formação.

-Wnt-3A meio condicionado é um dos reagentes mais importantes para te…

Materials

Advanced Dulbecco’s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500ml	Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen	#12634	stored at 4 °C
GlutaMax	Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen	#35050	stored at 4 °C
Hepes	Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen	# 15630-056	stored at 4 °C
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen	#15140-122	stored at -20 °C
96 well culture plate	Cellstar	#655180
24 well culture plate	Cellstar	#662160
6 well culture plate	Cellstar	#657160
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS)	Life Technologies: Gibco	#14190-094	stored at 4 °C
Dulbecco’s Modified Eagles Medium  (DMEM) 500ml	Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen	#31966-021	For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS)	Bovogen	#SFBS LOT#11113	For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at -20 °C
L Wnt3A cell line	ATCC	#CRL-2647	For Wnt-3A Conditioend Medium Production.
TOP/FOP plasmids	Millipore	#17-285	For measuring Wnt activity
pTK-Renilla	Promega	#E2241	For measuring Wnt activity
HEK-293	ATCC	#CRL-1573	For measuring Wnt activity
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	#E1910	For measuring Wnt activity
Zeocin	Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen	#R250-01	For Wnt-3A Cell line selection
B27 supplement	Thermo Fisher Scientific:  Invitrogen	#17504-044	stored at -20 °C
N-Acetylcysteine	Sigma Aldrich	#A9165-5G	stored at -20 °C
Nicotinamide	Sigma Aldrich	#N0636	stored at -20 °C
Human Epithelial Growth Factor (hEGF)	PrepoTech	#AF-100-15	stored at -20 °C
Gastrin	Sigma Aldrich	#G9145	stored at -20 °C
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)	Tocris	#2939	stored at -20 °C
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi)	Selleckchem	#S1049	stored at -20 °C
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)	Sigma Aldrich	#S7067	stored at -20 °C
Primocin	InvivoGen	#ant-pm-1	stored at -20 °C
Human Noggin (hNoggin)	PrepoTech	#120-10C	stored at -20 °C
Human R-spondin 3 (hRspo-3)	R&D Systems	#3500-RS/CF	stored at -20 °C
Vancomycin	Sigma Aldrich	#861987- 250mg	stored at -20 °C
Gentamycin	Life Technologies: Gibco	#15710-049	stored at -20 °C
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	#431788	Stored at 4 °C
Matrigel	Corning	#354230	stored at -80 °C
TryplE Express	Life Technologies: Gibco	#12605-010	for trypsinizing organoids for freezing
Recovery Cell Culture Freezing Medium	Life Technologies: Gibco	#12648010	for freezing
Calcein	Life Technologies: Gibco	#C3100MP	stored at -20 °C
Forskolin	R&D Systems	#1099-50 mg	stored at -80 °C
Lumacaftor (VX-809)	Selleckchem	#s1565	stored at -80 °C
Ivacaftor (VX-770)	Selleckchem	#s1144	stored at -80 °C
Name of Reagents/Material	Solvent	Stock Concentration	Final Concentration
GlutaMax		200 mM	2m M
Hepes		1 M	10 mM
Penicillin/Streptomycin		10K U/ml 10K µg/ml	100 U/ml 100 µg/ml
Zeocin		100 mg/ml	125 µg/ml
B27 supplement		100 x	1 x
N-Acetylcysteine	MiliQ H20	500 mM
Nicotinamide	DPBS	1 M	10 mM
Human Epithelial Growth Factor (hEGF)	DPBS 0.1%BSA	0.5 mg/ml	50 ng/ml
Gastrin	DPBS	100 µM	10 nM
TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01)	DMSO	5 mM	500 nM
Y-27632 dihydrochloride (RhoKi)	DMSO	10 mM	10 µM
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)	DMSO	30 mM	10 µM
Primocin		50 mg/ml	100 µg/ml
Human Noggin (hNoggin)	DPBS 0.1%BSA	100 µg/ml	100 ng/ml
Human R-spondin 3 (hRspo-3)		varies per lot	300 ng/ml
Vancomycin		10 mg/ml	50 µg/ml
Gentamycin		10 mg/ml	50 µg/ml
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	MiliQ H20	0.5 M	2 mM
Calcein	DMSO	10 µg/ml	3.3 ng/ml
Forskolin	DMSO	10 mM	variable
Lumacaftor (VX-809)	DMSO	20 mM	variable
Ivacaftor (VX-770)	DMSO	20 mM	variable