電気生理学的研究のための成体マウスの網膜の水平スライスの調製
Summary
私たちは、網膜の表面に平行に切片化の面で大人の哺乳類の網膜の水平スライス標本を開発しました。 nonradially指向の網膜神経細胞の樹状のフィールドは、パッチクランプおよびイメージング技術と信号処理の研究を可能にする、切り捨てられませんでした。
Abstract
垂直スライス標本はよく大人の哺乳類の網膜内の回路および信号伝送を研究するために設立されています。これらの製剤で切片の面は、光受容体と双極細胞のような半径方向に配向ニューロンの研究に最適です、網膜表面に対して垂直です。しかし、水平細胞、広視野アマクリン細胞、および神経節細胞の大きな樹状アーバは、これらの細胞中で著しく減少シナプス活性を残して、ほとんどが切り捨てられます。神経節細胞と変位アマクリン細胞は網膜の全体に取り付けられた準備に研究することができるのに対し、内顆粒層に位置する水平細胞とアマクリン細胞がわずかしか全体の網膜組織内の電極のためにアクセスできます。
最大のアクセシビリティとシナプス完全性を達成するために、我々は、マウス網膜の水平スライス標本を開発し、感光体と水平の間のシナプスでの信号伝達を研究しました細胞。水平方向の切片は、水平細胞の樹状突起に無傷で機能的なコーンシナプス入力のための前提条件として、電極の標的化のための水平細胞体の（1）簡単かつ明確な視覚識別、および拡張水平細胞の樹状のフィールド（2）保存を可能にします。
水平スライスからの水平細胞は暗所でトニックシナプス活性を示し、そして、彼らは内向き電流と減少したシナプス活性の低下と光の点滅を短時間に応答しました。免疫細胞化学的証拠は水平細胞の樹状フィールド内のほぼすべてのコーンはその周辺の樹状突起とシナプスを確立することを示しています。水平スライス標本は、したがって、水平方向に拡張網膜神経細胞の生理学的特性ならびに選択されたシナプス全体の感覚信号伝送との統合を研究するのに適しています。
Introduction
視覚情報は、感光体活性化の動的な時空間的パターンとして符号化され、光受容体および二次ニューロン間のリボンシナプスは、視覚情報の下流の転送を決定します。哺乳動物の網膜の垂直スライス標本、 すなわち光受容体と双極細胞との間、および双極細胞、およびアマクリン細胞1、2、3、4、いくつかのタイプの間で、垂直の経路の信号処理を研究するための非常に貴重なツールです。
しかし、垂直切片は常にシナプスの連絡先のかなりの損失につながる、多くの網膜神経細胞の樹状突起分野の厳しい切り捨てが発生します。特に、網膜の外側に、水平細胞は、それらの横に広がる拡張樹状のフィールドと軸索末端システム5に影響を受けます。垂直でスライス標本、水平細胞の樹状突起の円錐感光体端末の数百のシナプス入力は、このように、いくつかの疎コンタクトに低減されます。これは、個々のシナプスの特性を研究するためには十分かもしれないが、それは決してないが、感光体リボンシナプスの同期化された活性化の基礎となる信号処理機能を表します。
したがって、我々は、無傷で機能的な水平細胞の樹状突起にほぼすべての錐体光受容体のシナプス入力を離れる水平スライス標本を、開発しました。切片ランの面は、理想的には、水平細胞及びアマクリン細胞間の内顆粒層を通して切断し、網膜の表面に平行です。このように、外側の網膜の水平スライスを含んで作成され、シナプス前サイト上で、シナプス後サイト上の内側と外側のセグメントだけでなく、シナプス終末、および水平細胞と双極細胞と光受容体。この調製は、トンに非常に適していますOその樹状のフィールド内のすべての錐体視細胞、水平細胞の樹状突起に協調シナプス入力を調べます。したがって、より良い、シナプス後応答に感光体活性化のマトリックスからの視覚情報の伝達のために重要である感光体リボンシナプスの働きを理解するのに有用であることが分かるかもしれません。
Protocol
Representative Results
Discussion
垂直スライスとは対照的に、水平細胞とアマクリン細胞のような半径方向に配向ニューロンの樹状突起形態がよく保存されています。全網膜製剤と比較して、これらの細胞型は、微小電極のために容易にアクセス可能であり、両方の電気及びイメージング技術によって研究することができます。ここでは、網膜の外側に焦点を当てました。しかしながら、同様のアプローチは、特に、内網膜<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 and FE464/11-1 to A.F. The authors want to acknowledge the excellent technical assistance of Andrea Nerz.
Materials
| Ames' Medium | Sigma | A1420 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Carbogen | Air Liquide | ||
| Agarose | Sigma | A9045 | |
| 35-mm petri dish (plastic) | Nunc Thermofisher | 150318 | |
| Glass petri dish | Chemoline | 50-1470-40 | |
| Isoflurane | Dispensary university hospital | ||
| Vibratome injector blade | Biosystems | 39053250 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200 | |
| Vibrocheck | Leica Microsystems | ||
| Microwave | |||
| Water bath | |||
| Forceps | |||
| 20-gauge needles | |||
| Spring scissors | |||
| Curved scalpel blades | |||
| Stereo microscope | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Glass Pasteur pipette |
References
- DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse. Neuron. 50, 735-748 (2006).
- Jackman, S. L., et al. Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response. Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).
- Rabl, K., Cadetti, L., Thoreson, W. B. Kinetics of exocytosis is faster in cones than in rods. J. Neurosci. 25 (18), 4633-4640 (2005).
- Singer, J. H., Lassová, L., Vardi, N., Diamond, J. S. Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse. Nature Neuroscience. 7 (8), 826-833 (2004).
- Peichl, L., González-Soriano, J. Morphological types of horizontal cell in rodent retinae: a comparison of rat, mouse, gerbil, and guinea pig. Vis. Neurosci. 11, 501-517 (1994).
- Ames, A., Nesbett, F. B. In vitro retina as an experimental model of the central nervous system. J. Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).
- Mathis, D. M., Furman, J. J., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J. Vis. Exp. (49), (2011).
- Peichl, L., Sandmann, D., Boycott, B. B. Comparative anatomy and function of mammalian horizontal cells. Development of the Retina. , (1998).
- Feigenspan, A., Babai, N. Functional properties of spontaneous excitatory currents and encoding of light/dark transitions in horizontal cells of the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2615-2632 (2015).
- Enoki, R., Jakobs, T. C., Koizumi, A. Horizontal slice preparation of the retina. J. Vis. Exp. (1), e108 (2006).
- Babai, N., et al. Functional roles of complexin3 and complexin4 at mouse photoreceptor ribbon synapses. J. Neurosci. 36, 6651-6667 (2016).
- Thoreson, W. B. Horizontal slices of mouse retina expose horizontal cells and their properties (Commentary on Feigenspan & Babai). Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2613-2614 (2015).
