Analyse Synaptic Graduering af<em> Drosophila melanogaster</em> Fotoreceptorer efter Udsættelse for Langvarig Light
Summary
Her viser vi, hvordan at kvantificere antallet og rumlige fordeling af synaptiske aktive zoner i Drosophila melanogaster fotoreceptorer, fremhævet med en genetisk kodet molekylær markør, og deres modulation efter længere tids udsættelse for lys.
Abstract
Nervesystemet har den bemærkelsesværdige evne til at tilpasse og svare på forskellige stimuli. Denne neurale justering er i vid udstrækning gennem plasticitet på den synaptiske niveau. Den aktive zone (AZ) er den region på den præsynaptiske membran, der medierer neurotransmitterfrigivelse og er sammensat af en tæt samling af scaffold-proteiner. AZS af Drosophila melanogaster (Drosophila) fotoreceptorer gennemgår molekylær remodellering efter længere tids udsættelse for naturligt omgivende lys. Dermed omfanget af neuronal aktivitet kan omarrangere den molekylære sammensætning af AZ og bidrage til reguleringen af den funktionelle udgang.
Med udgangspunkt i den lyseksponering opsætning forberedelse til immunhistokemi, denne protokol detaljer, hvordan at kvantificere nummer, den rumlige fordeling og flytning niveau af synaptiske molekyler på Azs i Drosophila fotoreceptorer. Brug billedanalyse software, klynger af GFP-smeltet AZ komponent Bruchpilot blev identificeret for hver R8 fotoreceptorer (R8) Axon terminalen. Registrerede Bruchpilot spots blev automatisk tildelt individuelle R8 axoner. For at beregne fordelingen af spot frekvens langs Axon, vi implementeret en tilpasset software plugin. Hver axon start-point og endepunkt blev manuelt defineret og positionen af hver Bruchpilot spot blev projiceret op på forbindelseslinje mellem start og slutpunkt. Ud over antallet af Bruchpilot klynger, vi kvantificeret også flytning niveau af Bruchpilot-GFP inden for grupperne. Disse målinger afspejler i detaljer rumligt løst synaptiske dynamik i en enkelt neuron under forskellige miljøforhold på stimuli.
Introduction
Modulering af synaptisk funktion bidrager til den bemærkelsesværdige evne af nervesystemet til præcist reagere eller tilpasse sig skiftende miljømæssige stimuli. Justering af præsynaptiske vesikel release sandsynlighed er en måde at styre synaptisk styrke en. Synaptisk vesikel frigivelse finder sted på den aktive zone (AZ), en specialiseret region i den præsynaptiske membran 2. AZ er kendetegnet ved en kassette af specifikke proteiner 3, 4. De fleste proteiner, der bidrager til AZ samling er stærkt konserverede i nematoder, insekter og pattedyr 5. Nylige undersøgelser tyder på, at niveauet af neuronal aktivitet regulerer den molekylære sammensætning af AZ, hvilket igen bidrager til reguleringen af den funktionelle output både in vitro og in vivo 6, 7,> 8. Vi har tidligere fundet, at fotoreceptor AZS gennemgår molekylær ombygning i Drosophila efter længere tids udsættelse for naturligt omgivende lys 9. I denne tilstand, observerede vi, at antallet af Bruchpilot (BRP) -positiv AZS blev reduceret i fotoreceptor axoner.
BRP / CAST / ELKS familiens proteiner er fundamentale byggesten i Azs i hvirveldyr og hvirvelløse synapser 10. I Drosophila balanceansvarlige aktørs mutanter, fremkaldte vesikel frigivelse er undertrykt 11, 12. De 17 C-terminale aminosyrerester af BRP er afgørende for synaptisk vesikel klynger ved Drosophila neuromuskulære forbindelse (NMJ) 13, 14. Disse undersøgelser viste centrale rolle dette molekyle i AZ organisation og funktion. Med en nylig udviklet genetisk værktøj, Synaptic Tagging med Rekombination (stjerne), BRPkan observeres in vivo i specifikke celletyper, på endogene ekspressionsniveauer og ved en enkelt synapse beslutning 15. Dette værktøj gør det muligt at evaluere de endogene dynamik synapser kvantitativt i komplekset centralnervesystemet.
Der har været flere undersøgelser, herunder synapse kvantificeringer baseret på data indsamlet fra konfokal mikroskopi. Synaptiske ændringer er blevet evalueret ved at måle længden, området, volumen, densitet og tælle antallet baseret på avancerede programmer. For eksempel, freeware ImageJ giver en kvantificering metode til total synaptisk område og synaptiske foranstaltninger densitet på Drosophila NMJ 16. Antallet af co-lokaliseringstoppe steder af pre og postsynaptiske markører er blevet kvantificeret ved hjælp af plugin "puncta Analyzer" tilgængelige på ImageJ software platform 17. Alternativt, en multi-paradigm numerisk computermiljø baseret program, Synapse Detector (synd), kan automatisk spore dendritter af neuroner mærket med en fluorescerende markør, og derefter kvantificeres de synaptiske proteinniveauer som funktion af afstand fra cellelegemet 18. Den software Synaptic puncta Analysis (SynPAnal), er designet til hurtig analyse af 2D-billeder af neuroner erhvervet fra konfokal eller fluorescerende mikroskopi. Den primære funktion af denne software er den automatisk og hurtig kvantificering af tæthed og intensitet af protein puncta 19. For nylig har en automatisk læring-baserede synapse afsløring algoritme blevet genereret til kvantificering af synaptisk nummer i 3D 20, at drage fordel af 3D Visualisering-Assisted Analysis (Vaa3D) software 21.
Kommerciel billedanalyse software er også stærke værktøjer til synaptiske kvantificeringer. For eksempel den fluorescerendemærkede neurotransmitterreceptorer eller en præsynaptisk AZ komponent er blevet kvantificeret i tre dimensioner med en enkelt synapse beslutning i C. elegans 22 eller Drosophila lugtesystemet 23, 24, hvilket tillader hundreder af synapser, der skal hurtigt kendetegnet inden for en enkelt prøve.
Her præsenteres en fremgangsmåde ved en tilpasset billedanalyse software plug-in implementeret i en multi-paradigme numerisk computermiljø, der gør det muligt at analysere halvautomatisk flere aspekter af AZS, herunder deres nummer, fordeling og niveauet af berigelse af molekylære bestanddele til AZ. Således er denne komplekse analyse tilladt os at vurdere dynamikken i synaptiske bestanddele i axonterminaler under forskellige miljøforhold. Vi undersøgte effekten af lys eksponering på output synapser af voksne flyve fotoreceptorer. Proceduren udføres i tre trin: 1)forberedelse til lyseksponering, 2) dissektion, immunhistokemi og konfokal billeddannelse, og 3) billedanalyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne undersøgelse viste vi, hvordan du forbereder lysforholdene at udsætte fluer i lige lysintensitet. Vi kvantificeres ikke kun antallet af en synaptisk markør puncta men kunne også rumligt løse tætheden af synapser langs axoner og måle flytning niveau af markørproteinet i cytoplasmatiske områder. Disse tre vurderinger giver os mulighed for at vurdere detaljerne i synaptiske dynamik på enkelt neuron niveau i forskellige miljøforhold. Vores protokol kan tilpasses forskellige synaptiske proteiner, men…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for T. Stürner for nyttige rettelser, diskussioner og kommentarer til manuskriptet; SL Zipursky for at give flyve bestande; M Schölling til udførelse billedbehandling. En del af billedet analyse gennemføres ved A. Kakita laboratorium. Dette arbejde blev støttet af Alexander von Humboldt Foundation og JSP'er stipendier til forskning i udlandet (AS), JSP'er Fellows (SH-S.), Grant-In- Støtte til opstart (24.800.024), om innovative områder (25.110.713), Mochida, Takeda Inamori, Daiichi-Sankyo, Toray Foundations (TS), DZNE grundfinansiering (GT) og DZNE Light Microscopy Facility (CM).
Materials
| Vial | Hightech, Japan | MKC-20 | |
| Plug | Thermo Fisher Sciehtific, USA | AS-275 | |
| Customized transparent rack made of acrylic resin | Shin-Shin Corporation, Japan | a height of 41 cm, a base of 21 cm, a thickness of 4 cm and a height of 13 cm for each step | |
| Cool incubator | MITSUBISHI ELECTRIC, Japan | CN-40A | |
| LED panel | MISUMI, Japan | LEDXC170-W | |
| Digital light meter | CEM | DT-1301 | |
| Fly pad | Tokken, Japan | TK-HA03-S | |
| Petri dish (35 x 10 mm) | Greiner Bio-One International, Germany | 627102 | |
| PBS tablet | Takara, Japan | T900 | |
| Triton X-100 | Wako, Japan | 160-24751 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 1.5 ml tube | Sarstedt, Germany | A. 152X | |
| Formaldehyde 16% | NEM, Japan | 3152 | |
| Pipetman P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P-2 | Gilson | F144801 | |
| anti-chaoptin antibody | DSHB | 24B10 | |
| Alexa568-conjugated anti-mouse antibody | Life Technologies | A-11031 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Microscope slide (76 x 26 mm) | Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germany | ||
| Coverslip (18 x 18 mm, 0.17 mm) | Zeiss, Germany | 474030-9000-000 | |
| Industrial Microscopes | Olympus, Japan | SZ61-C-SET | |
| Stereo Microscope Lighting | Olympus, Japan | KL 1600 LED | |
| confocal microscopy | Zeiss, Germany | LSM780 | |
| Imaris | Bitplane, Switzerland | Version 7.6.4 or above | |
| Matlab | The MathWorks, Inc., USA | ||
| Excel for Mac | Microsoft |
References
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Synaptic Vesicle Pools and Dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (8), (2012).
- Couteaux, R., Pecot-Dechavassine, M. [Synaptic vesicles and pouches at the level of "active zones" of the neuromuscular junction]. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 271 (25), 2346-2349 (1970).
- Schoch, S., Gundelfinger, E. D. Molecular organization of the presynaptic active zone. Cell and Tissue Research. 326 (2), 379-391 (2006).
- Sudhof, T. C. The Presynaptic Active Zone. Neuron. 75 (1), 11-25 (2012).
- Owald, D., Sigrist, S. J. Assembling the presynaptic active zone. Curr Opin Neurobiol. 19 (3), 311-318 (2009).
- Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive remodeling of the presynaptic cytomatrix upon homeostatic adaptation to network activity silencing. J Neurosci. 31 (28), 10189-10200 (2011).
- Matz, J., Gilyan, A., Kolar, A., McCarvill, T., Krueger, S. R. Rapid structural alterations of the active zone lead to sustained changes in neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (19), 8836-8841 (2010).
- Spangler, S. A., et al. Liprin-alpha2 promotes the presynaptic recruitment and turnover of RIM1/CASK to facilitate synaptic transmission. J Cell Biol. 201 (6), 915-928 (2013).
- Sugie, A., et al. Molecular Remodeling of the Presynaptic Active Zone of Drosophila Photoreceptors via Activity-Dependent Feedback. Neuron. 86 (3), 711-725 (2015).
- Sigrist, S. J., Schmitz, D. Structural and functional plasticity of the cytoplasmic active zone. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 144-150 (2011).
- Kittel, R. J., et al. Active zone assembly and synaptic release. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 5), 939-941 (2006).
- Kittel, R. J., et al. Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release. Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).
- Hallermann, S., et al. Naked dense bodies provoke depression. J Neurosci. 30 (43), 14340-14345 (2010).
- Wagh, D. A., et al. Bruchpilot, a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila. Neuron. 49 (6), 833-844 (2006).
- Chen, Y., et al. Cell-type-specific labeling of synapses in vivo through synaptic tagging with recombination. Neuron. 81 (2), 280-293 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
- Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. J Neurosci Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
- Danielson, E., Lee, S. H. SynPAnal: software for rapid quantification of the density and intensity of protein puncta from fluorescence microscopy images of neurons. PLoS One. 9 (12), e115298 (2014).
- Sanders, J., Singh, A., Sterne, G., Ye, B., Zhou, J. Learning-guided automatic three dimensional synapse quantification for drosophila neurons. BMC Bioinformatics. 16, 177 (2015).
- Peng, H., Ruan, Z., Atasoy, D., Sternson, S. Automatic reconstruction of 3D neuron structures using a graph-augmented deformable model. Bioinformatics. 26 (12), i38-i46 (2010).
- Sturt, B. L., Bamber, B. A. Automated quantification of synaptic fluorescence in C. elegans. J Vis Exp. (66), (2012).
- Kremer, M. C., et al. Structural long-term changes at mushroom body input synapses. Curr Biol. 20 (21), 1938-1944 (2010).
- Mosca, T. J., Luo, L. Synaptic organization of the Drosophila antennal lobe and its regulation by the Teneurins. Elife. 3, e03726 (2014).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
- Fischbach, K. F., Dittrich, A. P. M. The Optic Lobe of Drosophila-Melanogaster .1 A Golgi Analysis of Wild-Type Structure. Cell and Tissue Research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Berger-Muller, S., et al. Assessing the role of cell-surface molecules in central synaptogenesis in the Drosophila visual system. PLoS One. 8 (12), e83732 (2013).
- Fouquet, W., et al. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186 (1), 129-145 (2009).
- Ke, M. T., et al. Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent. Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).
- Ehmann, N., et al. Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states. Nat Commun. 5, 4650 (2014).
