여기에 우리가 수와 초파리의 광 수용체의 시냅스 활성 영역의 공간적 분포를 정량화하는 방법을 보여, 유전자 인코딩 된 분자 마커 강조하고, 빛에 장시간 노출 후 자신의 변조.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
신경계는 적응하고 다양한 자극에 반응하는 놀라운 능력을 가지고 있습니다. 이 신경 조정은 크게 시냅스 수준에서 소성을 통해 달성된다. 활성 영역 (AZ)는 신경 전달 물질 방출을 매개과 골격 단백질의 조밀 한 컬렉션으로 구성되어 시냅스 막에서의 영역이다. 노랑 초파리의 AZS은 (초파리) 광 수용체 자연 주변 광에 장시간 노출 된 후 분자 리모델링을 받다. 따라서, 신경 세포 활성도의 레벨은 AZ의 분자 성분을 재 배열하여 출력 기능의 조절에 기여할 수있다.
면역 조직 화학에 빛을 노출 설정 준비에서 시작,이 프로토콜은 수, 공간적 분포 및 초파리의 광 수용체에 AZS에서 시냅스 분자의 비편 재화 수준을 정량화하는 방법을 자세히 설명합니다. 이미지 분석 SOF 사용tware의 GFP 융합 AZ 구성 요소 Bruchpilot의 클러스터는 각 R8의 광 수용체 (R8) 축삭 터미널 확인되었다. 감지 Bruchpilot 명소가 자동으로 개별 R8의 축삭에 할당되었다. 축삭을 따라 자리 주파수의 분포를 계산하기 위해, 우리는 사용자 정의 소프트웨어 플러그인을 구현했습니다. 각 축삭의 시작 지점과 끝 지점을 수동으로 정의 된 각 Bruchpilot 지점의 위치는 시작과 끝 지점 사이의 연결 라인에 투영되었다. Bruchpilot 클러스터의 수 외에, 우리는 또한 클러스터 내의 Bruchpilot-GFP의 비편 재화 수준을 정량화. 이러한 측정은 서로 다른 환경 조건 하에서 단일 신경 세포의 공간적 해결 시냅스 역학 자극에 구체적으로 반영합니다.
서론
시냅스 기능의 변조를 정확하게 대응 자극이나 환경 변화에 적응할 수있는 신경계의 놀라운 능력에 기여한다. 시냅스 소포 방출 확률을 조정 한 시냅스 강도를 제어하는 하나의 방법이다. 시냅스 소포 릴리스는 활성 영역 (AZ), 시냅스 막 2의 전문 영역에서 발생한다. AZ는 특정 단백질 (3)의 카세트, (4)에 의해 특징입니다. AZ 어셈블리에 기여하는 대부분의 단백질은 매우 선충, 곤충, 포유류 (5)에 보존되어있다. 최근의 연구는 신경 활동의 레벨이 차례로 모두 시험 관내 및 생체 내 (6, 7)의 출력 기능의 조절에 기여 AZ, 분자 조성을 조절하는 것을 제안> 8. 우리는 이전에 광 수용체 AZS 자연 환경 광 (9)에 장시간 노출 된 후 초파리의 분자 리모....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
이 프로토콜에 설명 된 실험 절차는 독점적으로 초파리와 함께 작동 것을 포함하고 독일과 일본에서 동물 복지 법률을 실시하지 않습니다.
1. 빛 노출 조건
- 광 수용체 R8 뉴런 (의 R8)에 BRP-GFP를 시각화 sensless-flippase (SENS-FLP) 및 bruchpilot-FRT-STOP-FRT-GFP (BRP-FSF-GFP) 15를 가지고 파리를 준비합니다. 세균 인공 염색체 (BAC) 내의 게놈 궤적 인코딩 BRP이 BRP-FSF-GFP 구조를 생성하도록 수정되었습니다. 이 변형 BAC에게 BRP-GFP의 발현을 수행 파리에서 내인성 조절 서열의 제어하에, 그러나 FRT-STOP-FRT 카세트 (15)의 sensless-flippase - 매개 R8 제거한 후 광 수용체로 제한. SENS-FLP 거의 R7S에 flippase 없음을 표현합니다.
- 12 시간 리에서 파리를 유지우화 (그림 1A)까지 유충 단계에서 25 ° C에서 G....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
초파리의 겹눈은 ~ 780 ommatidia, 개안을 포함, 광 수용체 각각 포함 8 종류 (R1-8). R7 및 R8 프로젝트가 층 M6와 M3, 각각 26 시냅스를 형성하는 두 번째 광학 신경절, 수질, 그들의 축삭. 광 수용체 R8 활성 영역의 분자 구성에 빛에 장시간 노출의 영향을 조사하기 위해, 우리는 별 방법 (15)을 이용했다. BRP의 내생 발현 수준은 형광 영상 축적 FLP에서 파생 된 R8의 광 수용체 표현 된 flippase와 BRP-FSF-GFP의 종결 코돈을 뒤집기로 표시 하였다. 25 ° C (그림 1A)에서 시간의 같은 기간 LL, LD 또는 DD의 우화 후 3 일 - 파리 1 동안 유지되었다. 1000 룩스의 빛에 노출시키기 파리, 파리는 아크릴 수지 랙 (도 1b.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
본 연구에서는 동일한 빛의 세기에 파리를 노출하는 조명 조건을 준비하는 방법을 보여 주었다. 우리는 단지 시냅스 마커 puncta의 수를 정량 아니라 축삭을 따라 공간적으로 시냅스의 밀도를 해결 세포질 영역에서 마커 단백질의 비편 재화 수준을 측정 할 수있다. 이 세 가지 평가는 우리가 다른 환경 조건에서 단일 신경 세포 수준에서 시냅스 역학의 세부 사항을 평가 할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 서로 다른 시냅스 단백질뿐만 아니라 반점 신호를 포함하는 모든 데이터에 적용 할 수 있습니다.
프로토콜 내에서 중요한 단계는 뇌의 장착입니다. 초파리의 광 수용체는 두 번째 광학 신경절 수질에 자신의 축삭 전망이다. 장착 뇌 올바르게 현미경 슬라이드 상에 배치 된 경우, 각 감광체 엑손이 노골적 스캔 할 수있다. 올바른 장착 또한 화상 해석 softwa와 감광체의 선택을하게쉽게 기능을 다시. 각 수광 영역 puncta의 수와 비편 재화 레벨 카운트 수동으로 선택해야한.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 원고에 도움이 수정, 토론 및 의견 T. Stürner에 감사하고 있습니다; 플라이 주식을 제공하는 SL Zipursky; 화상 처리를 행하는 M Schölling. 이미지 분석의 일부는 A. Kakita의 실험실에서 수행되었다. 이 작품은, 혁신적인 분야에 시동을위한 알렉산더 폰 훔볼트 재단과 JSPS 동호회 해외 연구 (AS), JSPS 휄로우 (SH-S.), 그랜트-IN- 원조 (24800024), (25110713), 모치다에 의해 지원되었다 다케다, 이나모리, 다이 이치 산쿄, 도레이 재단 (TS), DZNE 핵심 자금 (GT)과 DZNE 광학 현미경 시설 (CM).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Vial | Hightech, 일본 | MKC-20 | |
| 플러그 | Thermo Fisher Sciehtific, 미국 | AS-275 | |
| 아크릴 수지로 만든 맞춤형 투명 랙 | Shin-Shin Corporation, 일본 | 높이 41cm, 기부 21cm, 두께 4cm 및 각 단계 높이 13cm | |
| 쿨 인큐베이터 | MITSUBISHI ELECTRIC, 일본 | CN-40A | |
| LED 패널 | MISUMI, 일본 | LEDXC170-W | |
| 디지털 조도계 | CEM DT-1301 | ||
| 플라이 패드 | Tokken, 일본 | TK-HA03-S | |
| 페트리 접시 (35 x 10mm) | Greiner Bio-One International, 독일 | 627102 | |
| PBS 정제 | Takara, 일본 | T900 | |
| Triton X-100 | Wako, 일본 | 160-24751 | |
| Dumont #5 집게 | 파인 사이언스 도구 | 11251-20 | |
| 1.5 mL 튜브 | Sarstedt, 독일 | A. 152X | |
| 포름알데히드 16% | NEM, 일본 | 3152 | |
| Pipetman P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P-2 | Gilson | F144801 | |
| 항 chaoptin 항체 | DSHB | 24B10 | |
| Alexa568-conjugated anti-mouse 항체 | Life Technologies | A-11031 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| 현미경 슬라이드 (76 x 26 mm) | Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, 독일 | ||
| 커버슬립 (18 x 18 mm, 0.17 mm) | Zeiss, 독일 | 474030-9000-000 | |
| 산업용 현미경 | Olympus, 일본 | SZ61-C-SET | |
| 스테레오 현미경 조명 | Olympus, 일본 | KL 1600 LED | |
| 컨포칼 현미경 Zeiss | , 독일 | LSM780 | |
| Imaris | Bitplane, 스위스 | 버전 7.6.4 이상 | |
| Matlab | The MathWorks, Inc., USA | ||
| Excel, Mac | 마이크로소프트 |
참고문헌
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Synaptic Vesicle Pools and Dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (8), (2012).
- Couteaux, R., Pecot-Dechavassine, M. [Synaptic vesicles and pouches at the level of "....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
