en<em> Ex Vivo</em> Metode for Time-Lapse Imaging av Dyrkede Rat mesenteric mikrovaskulære nettverk
Summary
Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.
Abstract
Angiogenese, definert som veksten av nye blodkar fra pre-eksisterende fartøy, omfatter endotelceller, pericytes, glatte muskelceller, immunceller og samordning med lymfekar og nerver. Den multi-celle, multi-system interaksjoner nødvendig etterforskningen av angiogenese i en fysiologisk relevant miljø. Mens således anvendelse av in vitro cellekultur modeller har gitt mekanistiske innsikt, er en vanlig kritikk at de ikke rekapitulere kompleksiteten forbundet med en mikrovaskulær nettverk. Målet med denne protokollen er å vise evne til å gjøre time-lapse sammenligninger av intakte mikrovaskulære nettverk før og etter angiogenese stimulering i dyrkede rotte mesenteriet vev. Helstøpt vev inneholder mikrovaskulære nettverk som opprettholder deres hierarki. Immunhistokjemisk merking bekrefter tilstedeværelsen av endotelceller, glatte muskelceller, pericytes, blodkar og lymfekar. I enapparat.Foruten, merking vev med BSI-lektin muliggjør time-lapse sammenligning av lokale nettverks regioner før og etter serum eller vekstfaktor stimulering preget av økt kapillær spirende og fartøy tetthet. I forhold til vanlige cellekultur modeller, gir denne metoden et verktøy for endoteliale celle avstamning studier og vevsspesifikk angiogen medikament evaluering i fysiologisk relevante mikrovaskulære nettverk.
Introduction
Mikrovaskulær nettverk vekst og remodellering er fellesnevneren for vev funksjon, sårheling og flere patologier og en nøkkel prosess er angiogenese, definert som veksten av nye blodkar fra eksisterende 1, 2. For tissue engineering nye skip eller designe angiogene basert terapi, forstå betydningen av mobiltelefon dynamikk involvert i angiogenese er kritisk. Imidlertid er denne fremgangsmåte komplisert. Det kan variere på bestemte steder innenfor en mikrovaskulær nettverk og involverer flere celletyper (dvs. endotelceller, glatte muskelceller, pericytes, makrofager, stamceller) og flere systemer (lymfatisk nettverk og nevrale nettverk). Selv om in vitro-modeller har bidratt enormt til å undersøke sammenhengen mellom ulike celler involvert i angiogenese 3, kan deres fysiologiske relevans undergraves på grunn av thei r begrenset kompleksitet, og det faktum at de ikke gjenspeile en in vivo-situasjon. For å overvinne disse begrensningene, tredimensjonal kultur systemer 3, ex vivo vevsmodeller 4, microfluidic systemer 5, 6, og beregningsmodeller 7 er utviklet og innført de siste årene. Det er imidlertid fremdeles et behov for en modell med tidsintervall evne til å undersøke angiogenese i intakte mikrovaskulære nettverk ex vivo. Etablering av nye time-lapse modeller for angiogenese studier med at nivået av kompleksitet vil gi et uvurderlig verktøy for å forstå de underliggende mekanismene som regulerer angiogenese og bedre behandling.
En potensiell modell som gjør det mulig for ex vivo undersøkelser av angiogenese over en intakt microvascular nettverk er rotte mesentery kulturmodell> 8. I siste arbeid, har vi vist at blod og lymfatiske mikrovaskulære nettverk forbli levedyktig etter kultur. Enda viktigere, kan rotte mesentery kulturmodell brukes til å undersøke funksjonelle pericyte-endothelial celleinteraksjoner, blod og lymfatiske endotelcelle tilkoblinger, og time-lapse imaging. Målet med denne artikkelen er å gi vår protokoll for time-lapse imaging metode. Våre representative resultater dokumentere flere celletyper som forblir levedyktig etter stimulering av angiogenese med serum og tilbyr eksempler på bruk av denne metoden for å kvantifisere vev spesifikke angiogene responser samt endothelial celle sporing studier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen dokumenterer en metode for å bruke rotte mesentery kulturmodell som en ex vivo verktøy for time-lapse avbildning av mikrovaskulær nettverk vekst. Tidligere arbeid i vårt laboratorium har etablert ved bruk av vår modell for 1) angiogenese 8, 2) lymphangiogenesis 8, 3) pericyte-endotel-celleinteraksjoner 8, og 4) anti-angiogen drug testing 9. Muligheten for avbilding av dyrkede rotte-mesenteriet …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health Grant 5-P20GM103629 to WLM and the Tulane Center for Aging. We would like to thank Matthew Nice for his help with editing the protocol text.
Materials
| Drape | Cardinal Health | 4012 | 12”x12” Bio-Shield Regular Sterilization Wraps |
| Scalpel Handle | Roboz Surgical Instrument | RS-9843 | Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length |
| Sterile Surgical Blade | Cincinnati Surgical | 0110 | Stainless Steel; Size 10 |
| Culture Dish (60mm) | Thermo Scientific | 130181 | 10/Sleeve |
| Graefe Forcep (curved tweezers) | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length |
| Graefe Forcep (straight tweezers) | Roboz Surgical Instrument | RS-5130 | Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8mm Tip Width; 4" Length |
| Noyes Micro Scissor | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | Noyes Micro Dissecting Spring Scissors; Straight, Sharp-Blunt Points; 13mm Cutting Edge; 0.25mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length |
| Gauze Pads | FisherBrand | 13-761-52 | Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4"x4" 12-Ply |
| Cotton-Tippled Applicators | FisherBrand | 23-400-124 | 6" Length; Wooden Shaft; Single Use Only |
| 6-Well Plate | Fisher Scientific | 08-772-49 | Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic |
| Sterile Syring 5ml | Fisher Scientific | 14-829-45 | Luer-Lok Tip |
| Sterile Bowl | Medical Action Industries Inc. | 01232 | 32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use |
| 6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts) | SIGMA | Z681792-3EA | 6-Well Plate Inserts; Non-Sterile |
| Polycarbonate Filter Membrane | SIGMA | TMTP04700 | Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0 µm, 47 mm, White Plain |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Beuthanasia | Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 011168 | Active Ingredient: Per 100mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50mg phenytoin sodium |
| Ketamine | Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Kateset 100 mg/ml |
| Xylazine | LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Anased 100 mg/ml |
| Saline | Baxter | 2F7122 | |
| PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| MEM | Invitrogen | 11095080 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Saponin | SIGMA | S7900-100G | |
| Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | S25372 | |
| Povidone-Iodine | Operand | 82-226 | |
| Hydrochloric Acid | SIGMA | 320331 | |
| Methanol | Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| FITC-conjugated Lectin | SIGMA | L9381-2MG | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | SIGMA | AB5320 | |
| PECAM (CD31) Antibody | BD Biosciences | 555026 | |
| LYVE-1 Antibody | AngioBio Co. | 11-034 | |
| Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-585-144 | |
| Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-227-003 | |
| Streptavidin Cy3-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | SIGMA | B5002 | |
| Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine Clone Bu20a | Dako | M074401-8 | |
| Mouse Anti-Rat CD11b | AbD Serotec | MCA275R |
References
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress. Cell Mol Bioeng. 4 (4), 547-559 (2011).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15342-15347 (2011).
- Chan, J. M., et al. Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting. PLoS One. 7 (12), e50582 (2012).
- Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis. Curr Opin Hematol. 19 (3), 184-191 (2012).
- Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H235-H245 (2013).
- Azimi, M. S., et al. An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks. PLoS One. 10 (3), e0119227 (2015).
- Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab Invest. 63 (1), 115-122 (1990).
- Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels. Front Cell Dev Biol. 3, 52 (2015).
- Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat Protoc. 5 (10), 1659-1665 (2010).
- Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2347-2355 (2010).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
- Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks. Front Physiol. 4, 108 (2013).
- Kelly-Goss, M. R., et al. Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth. BMC Physiol. 12, 7 (2012).
- Skalak, T. C., Price, R. J. The role of mechanical stresses in microvascular remodeling. Microcirculation. 3 (2), 143-165 (1996).
- Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival. J Cell Physiol. 212 (1), 244-251 (2007).
- Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo. Microcirculation. 8 (4), 229-241 (2001).
- Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis. Microcirculation. 23 (2), 95-121 (2016).
