<em> Ex Vivo</em> Метод ЗАМЕДЛЕННАЯ визуализации культивируемых Rat брыжеечные микрососудистых сетей
Summary
Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.
Abstract
Ангиогенез, определяемый как рост новых кровеносных сосудов из уже существующих судов, включает в себя эндотелиальные клетки, перицитов, гладкие мышечные клетки, клетки иммунной системы, а также координацию с лимфатическими сосудами и нервами. Нескольких ячеек, многоступенчатая система взаимодействия требует исследование ангиогенеза в физиологически соответствующей среде. Таким образом, в то время как использование в пробирке моделей клеточных культур обеспечили механистических понимание, общая критика в том , что они не перепросматривать сложности , связанные с сетью микрососудов. Целью данного протокола является демонстрация возможности сделать покадровой сравнения неповрежденных микрососудистых сетей до и после стимуляции ангиогенеза в культуре тканей крыс брыжейки. Культивированный ткани содержат микрососудистых сетей, которые поддерживают их иерархию. Иммуногистохимическое маркировка подтверждает наличие эндотелиальных клеток, клеток гладкой мускулатуры, перицитов, кровеносных сосудов и лимфатических сосудов. Вddition, мечения тканей с BSI-лектинов позволяет сравнение замедленную регионов локальной сети до и после сыворотки или фактора роста стимуляции характеризуется повышенной капиллярной всходов и плотности сосудов. По сравнению с моделями общих клеточных культур, этот метод обеспечивает инструмент для исследования эндотелиальных клеток линии дифференцировки и ткани специфического ангиогенного оценки лекарственных средств в физиологически соответствующих капиллярных сетей.
Introduction
Рост сети микрососудов и ремоделирования являются общие знаменатели для функции тканей, заживление ран, а также несколько патологий и ключевой процесс ангиогенеза, определяется как рост новых кровеносных сосудов из существующих 1, 2. Для тканевой инженерии новых сосудов или проектирование ангиогенные терапии на основе, понимая важность клеточной динамики, вовлеченных в ангиогенез имеет решающее значение. Тем не менее, этот процесс является сложным. Он может варьироваться в определенных местах в пределах сети микрососудов и включает в себя несколько типов клеток (т.е. эндотелиальные клетки, клетки гладких мышц, перицитов, макрофаги, стволовые клетки) и несколько систем (лимфатическую сети и нейронных сетей). Хотя модели в пробирке внесли огромный вклад в изучение взаимосвязи между различными клетками , участвующими в ангиогенезе 3, их физиологическое значение может быть подорвана из – за Thei г ограниченную сложность и тот факт , что они не точно отражают сценарий в естественных условиях. Для преодоления этих ограничений, трехмерных систем культивирования 3, исключая виво модели ткани 4, микрофлюидальные системы 5, 6, и вычислительные модели 7 были разработаны и внедрены в последние годы. Тем не менее, все еще существует необходимость в модели с возможностью покадровой для исследования ангиогенеза в неповрежденных микрососудистых сетях бывших естественных условиях. Создание новых моделей покадровой для изучения ангиогенеза с этим уровнем сложности обеспечит бесценным инструментом, чтобы понять основные механизмы, регулирующие ангиогенез и улучшить методы лечения.
Потенциальная модель , которая позволяет ех естественных условиях исследование ангиогенеза через неповрежденной сети микрососудов является брыжейки модель культуры крысы> 8. В недавней работе мы показали, что в крови и лимфатической микрососудистых сети остаются жизнеспособными после культивирования. Что еще более важно, брыжейки модель культуры крысы могут быть использованы для исследования функциональных перицитов-эндотелиальной взаимодействия клеток, крови и лимфатической соединений эндотелиальных клеток и покадровой обработки изображений. Целью данной работы является предоставление нашего протокола для метода формирования изображений в заданный промежуток времени. Наши показательные результаты документирования нескольких типов клеток, которые остаются жизнеспособными после стимуляции ангиогенеза с сывороткой и предлагают примеры использования этого метода для количественной оценки тканей специфические ангиогенные ответов, а также исследования отслеживания клеток эндотелия.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол документов метод с использованием модели культуры крысы брыжейки в качестве инструмента для экс естественных условиях покадровой визуализации роста микрососудистой сети. Предыдущая работа в нашей лаборатории установила использование нашей модели 1) ангиогенеза <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health Grant 5-P20GM103629 to WLM and the Tulane Center for Aging. We would like to thank Matthew Nice for his help with editing the protocol text.
Materials
| Drape | Cardinal Health | 4012 | 12”x12” Bio-Shield Regular Sterilization Wraps |
| Scalpel Handle | Roboz Surgical Instrument | RS-9843 | Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length |
| Sterile Surgical Blade | Cincinnati Surgical | 0110 | Stainless Steel; Size 10 |
| Culture Dish (60mm) | Thermo Scientific | 130181 | 10/Sleeve |
| Graefe Forcep (curved tweezers) | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length |
| Graefe Forcep (straight tweezers) | Roboz Surgical Instrument | RS-5130 | Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8mm Tip Width; 4" Length |
| Noyes Micro Scissor | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | Noyes Micro Dissecting Spring Scissors; Straight, Sharp-Blunt Points; 13mm Cutting Edge; 0.25mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length |
| Gauze Pads | FisherBrand | 13-761-52 | Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4"x4" 12-Ply |
| Cotton-Tippled Applicators | FisherBrand | 23-400-124 | 6" Length; Wooden Shaft; Single Use Only |
| 6-Well Plate | Fisher Scientific | 08-772-49 | Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic |
| Sterile Syring 5ml | Fisher Scientific | 14-829-45 | Luer-Lok Tip |
| Sterile Bowl | Medical Action Industries Inc. | 01232 | 32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use |
| 6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts) | SIGMA | Z681792-3EA | 6-Well Plate Inserts; Non-Sterile |
| Polycarbonate Filter Membrane | SIGMA | TMTP04700 | Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0 µm, 47 mm, White Plain |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Beuthanasia | Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 011168 | Active Ingredient: Per 100mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50mg phenytoin sodium |
| Ketamine | Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Kateset 100 mg/ml |
| Xylazine | LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Anased 100 mg/ml |
| Saline | Baxter | 2F7122 | |
| PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| MEM | Invitrogen | 11095080 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Saponin | SIGMA | S7900-100G | |
| Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | S25372 | |
| Povidone-Iodine | Operand | 82-226 | |
| Hydrochloric Acid | SIGMA | 320331 | |
| Methanol | Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| FITC-conjugated Lectin | SIGMA | L9381-2MG | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | SIGMA | AB5320 | |
| PECAM (CD31) Antibody | BD Biosciences | 555026 | |
| LYVE-1 Antibody | AngioBio Co. | 11-034 | |
| Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-585-144 | |
| Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-227-003 | |
| Streptavidin Cy3-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | SIGMA | B5002 | |
| Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine Clone Bu20a | Dako | M074401-8 | |
| Mouse Anti-Rat CD11b | AbD Serotec | MCA275R |
References
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress. Cell Mol Bioeng. 4 (4), 547-559 (2011).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15342-15347 (2011).
- Chan, J. M., et al. Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting. PLoS One. 7 (12), e50582 (2012).
- Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis. Curr Opin Hematol. 19 (3), 184-191 (2012).
- Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H235-H245 (2013).
- Azimi, M. S., et al. An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks. PLoS One. 10 (3), e0119227 (2015).
- Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab Invest. 63 (1), 115-122 (1990).
- Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels. Front Cell Dev Biol. 3, 52 (2015).
- Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat Protoc. 5 (10), 1659-1665 (2010).
- Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2347-2355 (2010).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
- Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks. Front Physiol. 4, 108 (2013).
- Kelly-Goss, M. R., et al. Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth. BMC Physiol. 12, 7 (2012).
- Skalak, T. C., Price, R. J. The role of mechanical stresses in microvascular remodeling. Microcirculation. 3 (2), 143-165 (1996).
- Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival. J Cell Physiol. 212 (1), 244-251 (2007).
- Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo. Microcirculation. 8 (4), 229-241 (2001).
- Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis. Microcirculation. 23 (2), 95-121 (2016).
