bir<em> Ex Vivo</em> Yöntem kültürlü Rat Mezenterik Mikrovasküler Ağları Time-Lapse Görüntüleme için
Summary
Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.
Abstract
Anjiyojenez, önceden mevcut damarlardan yeni kan damarlarının büyümesi olarak tanımlanır, endotel hücreleri, perisitler, düz kas hücreleri, bağışıklık hücreleri ve lenf damarları ve sinirler koordinasyon içinde yapılmalıdır. çok hücreli, multi-sistem etkileşimleri fizyolojik ilgili bir ortamda anjiyogenezisteki soruşturma gerektirmektedir. In vitro hücre kültürü modelleri kullanımı bakış açıları sağladı Böylece, ortak bir eleştiri bir mikrovasküler ağı ile ortaya çıkan karmaşıklık özetlemek kalmamasıdır. Bu protokolün amacı, öncesi ve kültürlü sıçan mezenter dokularında anjiyogenez uyarılmasından sonra bozulmamış mikrovasküler ağlarının zaman atlamalı karşılaştırmalar yapabilme yeteneği göstermektir. Kültürlü dokuların hiyerarşi korumak mikrovasküler ağları içerir. İmmünohistokimyasal markalama endotel hücreleri, düz kas hücreleri, perisitler, kan damarları ve lenf damarlarının varlığını teyit. İçindeAyrıca bu yöntem, BSI-lektin ile dokuları etiketleme önce ve artan kapiller filizlenmesi ve damar yoğunluğu ile karakterize serum veya büyüme faktörü uyarılmasından sonra yerel ağ bölgelerin time-lapse karşılaştırılmasına olanak sağlamaktadır. Ortak hücre kültürü modelleri ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, fizyolojik olarak uygun mikrovasküler ağlarda endoteliyal hücre soyu çalışmaları ve dokuya özel anjiyojenik madde değerlendirilmesi için bir araç sağlar.
Introduction
Mikrovasküler ağ büyüme ve yeniden doku işlevi için ortak paydası, yara iyileşmesi, ve birden çok patoloji ve önemli bir proses, mevcut olanlar 1, 2, yeni kan damarlarının büyümesi olarak tanımlanır, anjiyojenez ise. yeni gemiler mühendislik veya anjiyogenez katılan hücresel dinamiklerin önemini anlayarak, anjiyogenik dayalı tedaviler tasarımı dokuya için kritik öneme sahiptir. Ancak, bu işlem karmaşıktır. Bir mikrovasküler ağ içinde belirli yerlerde değişiklik ve çoklu hücre tipleri (örneğin endotel hücrelerini, düz kas hücreleri perisitleri, makrofajlar, kök hücreler) ve birden fazla sistemi (lenfatik ağları ve yapay sinir ağları) içerir olabilir. In vitro modeller anjiyogenez 3 katılan farklı hücreler arasındaki ilişkiyi inceleyen çok büyük katkıları olmasına rağmen, onların fizyolojik alaka thei nedeniyle zarar olabilir Sınırlı karmaşıklığı ve yakından in vivo senaryoyu yansıtmayan gerçeğini r. Bu sınırlamaları, üç boyutlu kültür sistemleri üstesinden gelmek için 3, ex vivo doku modelleri 4, mikroakışkan sistemleri 5, 6, ve son yıllarda geliştirilmiş ve tanıtılmıştır 7 hesaplama modelleri. Bununla birlikte, sağlam mikrovasküler ağ ex vivo anjiyojenezi araştırmak için hızlandırılmış yeteneğine sahip bir model için hala bir ihtiyaç vardır. karmaşıklık düzeyi ile anjiyogenez çalışmaları için yeni time-lapse modellerinin kurulması anjiyogenez düzenleyen altında yatan mekanizmaları anlamak için paha biçilmez bir araç sağlayacak ve tedavileri geliştirmek.
Sağlam bir mikrovasküler ağ üzerinden anjiyogenez ex vivo soruşturma sağlayan bir potansiyel modeli sıçan mezenter kültür modeli> 8. Son çalışmada, kan ve lenfatik mikrovasküler ağları kültür sonra canlı kalır olduğunu göstermiştir. Daha da önemlisi, sıçan mezenter kültür modeli fonksiyonel pericyte-endotel hücre etkileşimleri, kan ve lenfatik endotel hücre bağlantıları ve zaman atlamalı görüntüleme araştırmak için kullanılabilir. Bu makalenin amacı time-lapse görüntüleme yöntemi için protokol sağlamaktır. Bizim Örnek sonuçlar serumu ile anjiyojenezin uyarılmasında sonra canlı kalır ve dokuya özel anjiyojenik yanıtlar gibi endotel hücre takibi çalışmaları ölçülmesi için bu yöntemi kullanarak örnekleri sunmaktadır çok sayıda hücre türleri belge.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol mikrovasküler ağ büyüme time-lapse görüntüleme için bir ex vivo aracı olarak sıçan mezenter kültür modeli kullanılarak için bir yöntem belgelemektedir. Laboratuvarımızda Önceki çalışmaları, 1 yönelik modeli) anjiyojenez 8, 2) lenfanjiyogenez 8, 3) perisit-endotelyal hücre etkileşimleri 8 ve 4), anti-anjiyojenik madde testi 9'a göre bir kullanım oluş…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health Grant 5-P20GM103629 to WLM and the Tulane Center for Aging. We would like to thank Matthew Nice for his help with editing the protocol text.
Materials
| Drape | Cardinal Health | 4012 | 12”x12” Bio-Shield Regular Sterilization Wraps |
| Scalpel Handle | Roboz Surgical Instrument | RS-9843 | Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length |
| Sterile Surgical Blade | Cincinnati Surgical | 0110 | Stainless Steel; Size 10 |
| Culture Dish (60mm) | Thermo Scientific | 130181 | 10/Sleeve |
| Graefe Forcep (curved tweezers) | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length |
| Graefe Forcep (straight tweezers) | Roboz Surgical Instrument | RS-5130 | Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8mm Tip Width; 4" Length |
| Noyes Micro Scissor | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | Noyes Micro Dissecting Spring Scissors; Straight, Sharp-Blunt Points; 13mm Cutting Edge; 0.25mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length |
| Gauze Pads | FisherBrand | 13-761-52 | Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4"x4" 12-Ply |
| Cotton-Tippled Applicators | FisherBrand | 23-400-124 | 6" Length; Wooden Shaft; Single Use Only |
| 6-Well Plate | Fisher Scientific | 08-772-49 | Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic |
| Sterile Syring 5ml | Fisher Scientific | 14-829-45 | Luer-Lok Tip |
| Sterile Bowl | Medical Action Industries Inc. | 01232 | 32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use |
| 6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts) | SIGMA | Z681792-3EA | 6-Well Plate Inserts; Non-Sterile |
| Polycarbonate Filter Membrane | SIGMA | TMTP04700 | Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0 µm, 47 mm, White Plain |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Beuthanasia | Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 011168 | Active Ingredient: Per 100mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50mg phenytoin sodium |
| Ketamine | Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Kateset 100 mg/ml |
| Xylazine | LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Anased 100 mg/ml |
| Saline | Baxter | 2F7122 | |
| PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| MEM | Invitrogen | 11095080 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Saponin | SIGMA | S7900-100G | |
| Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | S25372 | |
| Povidone-Iodine | Operand | 82-226 | |
| Hydrochloric Acid | SIGMA | 320331 | |
| Methanol | Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| FITC-conjugated Lectin | SIGMA | L9381-2MG | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | SIGMA | AB5320 | |
| PECAM (CD31) Antibody | BD Biosciences | 555026 | |
| LYVE-1 Antibody | AngioBio Co. | 11-034 | |
| Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-585-144 | |
| Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-227-003 | |
| Streptavidin Cy3-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | SIGMA | B5002 | |
| Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine Clone Bu20a | Dako | M074401-8 | |
| Mouse Anti-Rat CD11b | AbD Serotec | MCA275R |
References
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress. Cell Mol Bioeng. 4 (4), 547-559 (2011).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15342-15347 (2011).
- Chan, J. M., et al. Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting. PLoS One. 7 (12), e50582 (2012).
- Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis. Curr Opin Hematol. 19 (3), 184-191 (2012).
- Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H235-H245 (2013).
- Azimi, M. S., et al. An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks. PLoS One. 10 (3), e0119227 (2015).
- Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab Invest. 63 (1), 115-122 (1990).
- Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels. Front Cell Dev Biol. 3, 52 (2015).
- Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat Protoc. 5 (10), 1659-1665 (2010).
- Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2347-2355 (2010).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
- Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks. Front Physiol. 4, 108 (2013).
- Kelly-Goss, M. R., et al. Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth. BMC Physiol. 12, 7 (2012).
- Skalak, T. C., Price, R. J. The role of mechanical stresses in microvascular remodeling. Microcirculation. 3 (2), 143-165 (1996).
- Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival. J Cell Physiol. 212 (1), 244-251 (2007).
- Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo. Microcirculation. 8 (4), 229-241 (2001).
- Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis. Microcirculation. 23 (2), 95-121 (2016).
