Summary

Inducible T7 RNA polimerasa mediada Multigene Expression System, pMGX

Published: June 27, 2017
doi:

Summary

Este estudio describe métodos para la co-expresión mediada por T7 de múltiples genes de un único plásmido en Escherichia coli usando el sistema de plásmido pMGX.

Abstract

La co-expresión de múltiples proteínas es cada vez más esencial para la biología sintética, estudiando los complejos proteína-proteína, y caracterizando y aprovechando las vías biosintéticas. En este manuscrito, se describe el uso de un sistema altamente eficaz para la construcción de operones sintéticos multigénicos bajo el control de una ARN polimerasa T7 inducible. Este sistema permite que muchos genes se expresen simultáneamente a partir de un plásmido. En este caso, un conjunto de cuatro vectores relacionados, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K y pMGX-hisK, con el marcador seleccionable de resistencia a la ampicilina o la kanamicina (A y K) y que poseen o carecen de una hexahistidina N-terminal Etiqueta (su) se describen. Se proporcionan protocolos detallados para la construcción de operones sintéticos usando este sistema vectorial junto con los datos correspondientes, mostrando que un sistema basado en pMGX que contiene cinco genes puede ser fácilmente construido y usado para producir las cinco proteínas codificadas en Escherichia coli . Este sistemaEm y el protocolo permite a los investigadores a rutinariamente expresar complejos módulos de múltiples componentes y vías en E. coli .

Introduction

La co-expresión de múltiples proteínas es cada vez más esencial, particularmente en las aplicaciones de biología sintética, donde se deben expresar múltiples módulos funcionales 1 ; En el estudio de complejos proteína-proteína, donde la expresión y la función a menudo requieren co-expresión 2 , 3 ; Y en la caracterización y el aprovechamiento de las vías biosintéticas, en las que cada gen en la vía debe expresarse 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Se han desarrollado varios sistemas para la co-expresión, particularmente en el organismo huésped Escherichia coli , el caballo de trabajo para la expresión de proteínas recombinantes en laboratorio 9 . Por ejemplo, se pueden usar múltiples plásmidos con diferentes marcadores seleccionables para expresar proteínas individuales utilizando una gran cantidad de diferentes ex Vectores de presión 10 , 11 . Los sistemas individuales de plásmido para la expresión de múltiples proteínas han utilizado múltiples promotores para controlar la expresión de cada gen 10 , 12 ; Operones sintéticos, donde múltiples genes se codifican en un solo transcrito 2 , 13 ; O, en algunos casos, un solo gen que codifica un polipéptido que se procesa en última instancia proteolíticamente, produciendo las proteínas deseadas de interés 14 .

Figura 1
Figura 1: Flujo de trabajo pMGX mostrando la construcción de un vector policistrónico. El sistema pMGX proporciona una estrategia flexible y fácil de usar para la construcción de operones sintéticos bajo el control de un promotor T7 inducible.E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En este manuscrito, se describe el uso de un sistema altamente eficaz para la construcción de operones sintéticos multigénicos bajo el control de una ARN polimerasa T7 inducible ( Figura 1 ). Este sistema permite que muchos genes se expresen simultáneamente a partir de un plásmido. Se basa en un sistema de plásmidos, originalmente llamado pKH22, que se ha utilizado con éxito para un número de diferentes aplicaciones 6 , 7 , 8 . En este caso, este conjunto de plásmidos se amplía para incluir cuatro vectores relacionados: pMGX-A, un vector de expresión que carece de etiquetas C o N-terminales y con el marcador de resistencia a la ampicilina; PMGX-hisA, un vector de expresión que codifica una etiqueta de hexahistidina N-terminal y con el marcador de resistencia a la ampicilina; PMGX-K, un vector de expresión lMarcar cualquier marcador C o N-terminal y con el marcador de resistencia a la kanamicina; Y pMGX-hisK, un vector de expresión que codifica una etiqueta de hexahistidina N-terminal y con el marcador de resistencia a la kanamicina. En este estudio, se demuestra el método para generar un vector policistrónico que contiene cinco genes usando el sistema pMGX, específicamente pMGX-A, junto con la producción exitosa de cada proteína individual en Escherichia coli .

Protocol

1. Obtención de genes de interés Diseño de genes sintéticos. Optimizar una secuencia génica para la expresión de E. coli . Elimine cualquier sitio de restricción problemático de la secuencia (AvrII, NdeI, EcoRI y XbaI). Incorporar sitios de restricción para la clonación; Se recomienda un sitio 5'-NdeI y un sitio 3'-EcoRI. Otros sitios pueden ser usados, si es necesario; Se refieren a la región de clonación múltiple del plásmido selec…

Representative Results

En este estudio, el objetivo era co-expresar cinco proteínas de un solo plásmido. Los fragmentos de gen sintéticos optimizados con cinco codones que codifican etiquetas de hexahistidina N- o C-terminal se compraron comercialmente. Los genes sintéticos se amplificaron por PCR y se clonaron individualmente en un vector PCR-blunt y se secuenciaron. Para generar el plásmido policistrónico, los cinco genes de interés se clonaron primero en un plásmido pMGX adecuado, pMGX-A. <strong cl…

Discussion

La co-expresión de múltiples genes es cada vez más esencial, en particular en la caracterización y reconstitución complejas, multigénicas vías metabólicas [ 3 , 4 , 5] . El sistema pMGX hace co-expresión multigén en la rutina de E. coli 6 , 7 , 8 y accesible a diversos investigadores. En este …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá.

Materials

Enzymes
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) New England Biolabs M0290S
AvrII New England Biolabs R0174S
EcoRI New England Biolabs R0101S
NdeI New England Biolabs R0111S
XbaI New England Biolabs R0145S
Herculase II Fusion DNA Polymerase Agilent Technologies 600677
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
1 kb DNA ladder New England Biolabs N3232L
4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels Bio-Rad 456-8095
50 x TAE Fisher Thermo Scientific BP1332-4
Agar Fisher Thermo Scientific BP1423-500
Agarose Fisher Thermo Scientific BP160-500
Ampicilin Sigma-Alrich A9518-5G
BL21 (DE3) chemically comeptent cells Comeptent cell prepared in house
B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent Fisher Thermo Scientific PI78243
dNTP mix Agilent Technologies Supplied with polymerase
Gel Extraction Kit Omega D2500-02 E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972
Glycine Fisher Thermo Scientific BP381-1
His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse GenScript A00612
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate EMD Millipore WBKLS0100
IPTG Sigma-Alrich 15502-10G
LB Fisher Thermo Scientific BP1426-500
Methanol Fisher Thermo Scientific A411-20
Pasteurized instant skim milk powder Local grocery store No-name grocery store milk is adequate
Nitrocellulose membrane Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences) 10600007 Membrane PT 0.45 µm 200 mm X 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086
Plasmid DNA Isolation Kit Omega D6943-02 E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898
pMGX Boddy Lab Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca
Primers Intergrated DNA Technologies Design primers as needed for desired gene
Synthetic Gene Life Technologies Design and optimize as needed
Thick Blot Filter Paper Bio-Rad 1703932
Tris base BioShop TRS001.1
Tween-20 Sigma-Alrich P9416-50ML
XL1-Blue chemically competent cells Comeptent cell prepared in house
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
BioSpectrometer Eppendorf RK-83600-07
Gel box – PAGE Bio-Rad 1658005 Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell
Gel Imager Alpha Innotech AlphaImager EC
Incubator-oven Fisher Thermo Scientific 11-690-650D Isotemp
Incubator-shaker Fisher Thermo Scientific SHKE6000-7 MaxQ 6000
Personna Razors Fisher Thermo Scientific S04615
Power Pack Bio-Rad S65533Q FB300
Transilluminator VWR International M-10E,6W
Thermocylcer Eppendorf Z316091 Mastercycler Personal, supplied by Sigma
UV Face-Shield 18-999-4542
Waterbath Fisher Thermo Scientific 15-460-2SQ
Western Transfer Apparatus Bio-Rad 1703935 Mini-Trans Blot Cell

References

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Cite This Article
Hassan, M. I., McSorley, F. R., Hotta, K., Boddy, C. N. Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX. J. Vis. Exp. (124), e55187, doi:10.3791/55187 (2017).

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