مستحلب T7 الحمض النووي الريبي البلمرة بوساطة مولتيجين نظام التعبير، بمغس
Summary
وتصف هذه الدراسة طرق للتعبير المشترك بوساطة T7 من جينات متعددة من البلازميد واحد في القولونية الإشريكية باستخدام نظام البلازميد بمغس.
Abstract
ويعتبر التعبير المشترك عن بروتينات متعددة أمرا ضروريا بشكل متزايد للبيولوجيا التركيبية، ودراسة مجمعات البروتينات البروتينية، وتوصيف وتسخير المسارات الحيوية. في هذه المخطوطة، يتم وصف استخدام نظام فعال للغاية لبناء أوبيرونات الاصطناعية مولتيجين تحت سيطرة بوليميراز T7 الحمض النووي الريبي. هذا النظام يسمح العديد من الجينات ليتم التعبير عنها في وقت واحد من البلازميد واحد. هنا، مجموعة من أربعة ناقلات ذات الصلة، بمغس-A، بمغس-هيسا، بمغس-K، و بمغكس-هيسك، مع امبيسلين أو كاناميسين مقاومة اختيار علامة (A و K) وإما امتلاك أو تفتقر إلى N- محطة هيكساهستيدين علامة (له) يتم الكشف عنها. يتم توفير بروتوكولات مفصلة لبناء الأوبرونات الاصطناعية باستخدام هذا النظام المتجه جنبا إلى جنب مع البيانات المقابلة، تبين أن نظام القائم على بمغس تحتوي على خمسة جينات يمكن أن تكون شيدت بسهولة واستخدامها لإنتاج جميع البروتينات المشفرة الخمسة في الإشريكية القولونية . هذا الكيسإم والبروتوكول تمكن الباحثين من التعبير بشكل روتيني عن وحدات معقدة متعددة المكونات والمسارات في E. القولونية .
Introduction
ويعتبر التعبير المشترك عن بروتينات متعددة أمرا ضروريا بشكل متزايد، لا سيما في تطبيقات البيولوجيا التخليقية، حيث يجب التعبير عن وحدات وظيفية متعددة 1 ؛ في دراسة البروتينات المجمعات البروتين، حيث التعبير وظيفة غالبا ما تتطلب تعبير مشترك 2 ، 3 ؛ وفي تحديد وتسخير المسارات الحيوية، حيث يجب التعبير عن كل جين في المسار 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8 . وقد تم تطوير عدد من النظم للتعبير المشترك، وخاصة في الكائن المضيف الكولي القولونية ، الحصان العمل للتعبير المختبري البروتين المؤتلف 9 . على سبيل المثال، يمكن استخدام البلازميدات متعددة مع علامات اختيار مختلفة للتعبير عن البروتينات الفردية باستخدام ثروة من مختلف السابقين ناقلات بريسيون 10 ، 11 . وقد استخدمت أنظمة البلازميد واحدة لتعبير البروتين متعددة إما المروجين متعددة للسيطرة على التعبير عن كل جين 10 ، 12 ؛ أوبيرونات الاصطناعية، حيث يتم ترميز العديد من الجينات على نص واحد 2 ، 13 ؛ أو، في بعض الحالات، جين واحد ترميز ببتيد التي تتم معالجتها في نهاية المطاف بروتيوليتيكالي، مما أسفر عن البروتينات المطلوبة من الفائدة 14 .
الشكل 1: بمغكس سير العمل تظهر بناء متجه بوليسيسترونيك. يوفر نظام بمغس استراتيجية مرنة وسهلة الاستخدام لبناء الأوبرونات الاصطناعية تحت سيطرة المروج T7 محرض.e.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
في هذه المخطوطة، يتم وصف استخدام نظام فعال للغاية لبناء مولدات الجينات الاصطناعية تحت سيطرة T7 الحمض النووي الريبي البلمرة ( الشكل 1 ). هذا النظام يسمح العديد من الجينات ليتم التعبير عنها في وقت واحد من البلازميد واحد. لأنه يقوم على نظام البلازميد، ودعا في الأصل pKH22، التي تم استخدامها بنجاح لعدد من التطبيقات المختلفة 6 ، 7 ، 8 . هنا، يتم توسيع هذه المجموعة البلازميد لتشمل أربعة ناقلات ذات الصلة: بمغس-A، ناقلات التعبير تفتقر إلى أي علامات C- أو N- المحطة ومع علامة مقاومة الأمبيسلين. بمغس-هيسا، ناقلات التعبير ترميز علامة هيكساهستيدين N- محطة ومع علامة مقاومة الأمبيسلين. بمغس-K، ناقلات التعبير lأي علامات C- أو N- محطة ومع علامة مقاومة الكاناميسين. و بمغس-هيسك، ناقلات التعبير ترميز علامة هيكساهستيدين N- محطة ومع علامة المقاومة كانامايسين. في هذه الدراسة، وتظهر طريقة لتوليد ناقلات بوليسيسترونيك التي تحتوي على خمسة الجينات باستخدام نظام بمغكس، تحديدا بمغس-A، جنبا إلى جنب مع الإنتاج الناجح لكل بروتين الفردية في القولونية .
Protocol
Representative Results
Discussion
ويعتبر التعبير المشترك عن الجينات المتعددة أمرا ضروريا بشكل متزايد، خاصة في تحديد وإعادة تشكيل مسارات الأيض المعقدة المتعددة الأقطاب 3 و 4 و 5 . نظام بمغس يجعل مولتيجين شارك في التعبير في E. القولونية الروتينية <su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل من قبل مجلس العلوم الطبيعية والهندسة البحوث في كندا.
Materials
| Enzymes | |||
| Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England Biolabs | M0290S | |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | |
| Herculase II Fusion DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600677 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 1 kb DNA ladder | New England Biolabs | N3232L | |
| 4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels | Bio-Rad | 456-8095 | |
| 50 x TAE | Fisher Thermo Scientific | BP1332-4 | |
| Agar | Fisher Thermo Scientific | BP1423-500 | |
| Agarose | Fisher Thermo Scientific | BP160-500 | |
| Ampicilin | Sigma-Alrich | A9518-5G | |
| BL21 (DE3) chemically comeptent cells | Comeptent cell prepared in house | ||
| B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent | Fisher Thermo Scientific | PI78243 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies | Supplied with polymerase | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500-02 | E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972 |
| Glycine | Fisher Thermo Scientific | BP381-1 | |
| His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse | GenScript | A00612 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | EMD Millipore | WBKLS0100 | |
| IPTG | Sigma-Alrich | 15502-10G | |
| LB | Fisher Thermo Scientific | BP1426-500 | |
| Methanol | Fisher Thermo Scientific | A411-20 | |
| Pasteurized instant skim milk powder | Local grocery store | No-name grocery store milk is adequate | |
| Nitrocellulose membrane | Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences) | 10600007 | Membrane PT 0.45 µm 200 mm X 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086 |
| Plasmid DNA Isolation Kit | Omega | D6943-02 | E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898 |
| pMGX | Boddy Lab | Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca | |
| Primers | Intergrated DNA Technologies | Design primers as needed for desired gene | |
| Synthetic Gene | Life Technologies | Design and optimize as needed | |
| Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Tris base | BioShop | TRS001.1 | |
| Tween-20 | Sigma-Alrich | P9416-50ML | |
| XL1-Blue chemically competent cells | Comeptent cell prepared in house | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| BioSpectrometer | Eppendorf | RK-83600-07 | |
| Gel box – PAGE | Bio-Rad | 1658005 | Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell |
| Gel Imager | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| Incubator-oven | Fisher Thermo Scientific | 11-690-650D | Isotemp |
| Incubator-shaker | Fisher Thermo Scientific | SHKE6000-7 | MaxQ 6000 |
| Personna Razors | Fisher Thermo Scientific | S04615 | |
| Power Pack | Bio-Rad | S65533Q | FB300 |
| Transilluminator | VWR International | M-10E,6W | |
| Thermocylcer | Eppendorf | Z316091 | Mastercycler Personal, supplied by Sigma |
| UV Face-Shield | 18-999-4542 | ||
| Waterbath | Fisher Thermo Scientific | 15-460-2SQ | |
| Western Transfer Apparatus | Bio-Rad | 1703935 | Mini-Trans Blot Cell |
References
- Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).
- Bieniossek, C., et al. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
- Jochimsen, B., et al. Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).
- Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids. Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).
- Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
- Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).
- Lundgren, B. R., Boddy, C. N. Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli. Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).
- Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery. Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).
- Romier, C., et al. Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies. Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).
- Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. Strategies for protein coexpression in Escherichia coli. Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).
- Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
- Kim, K. -. J., et al. Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes. Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).
- Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).
- Chen, X., Pham, E., Truong, K. TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector. Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), (2012).
- Sukumaran, S. Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), (2011).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp Available from: https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2016)
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp Available from: https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016)
- Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J. Vis. Exp. (27), (2009).
