이 연구는 pMGX 플라스미드 시스템을 사용하여 대장균 에서 단일 플라스미드로부터 다중 유전자의 T7 매개 공동 - 발현을위한 방법을 기술한다.
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방법 논문
유도 성 T7 RNA 중합 효소 매개 멀티젠 발현 시스템, pMGX
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
여러 단백질의 동시 발현은 합성 생물학, 단백질 - 단백질 복합체 연구, 생합성 경로 규명 및 활용에 점점 더 필수적입니다. 이 원고에서, 유도 성 T7 RNA 중합 효소의 조절하에 multigene 합성 오페론의 건설을위한 매우 효과적인 시스템의 사용이 설명된다. 이 시스템은 많은 유전자가 한 플라스미드에서 동시에 발현되도록합니다. 여기서, 암피실린 또는 카나마이신 내성 선택 마커 (A 및 K) 및 N 말단 헥사 히스티딘을 보유하거나 보유하지 않은 4 개의 관련된 벡터, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K 및 pMGX-hisK의 세트 태그 (his)가 공개됩니다. 이 벡터 시스템을 이용한 합성 오페론의 구축을위한 상세한 프로토콜은 대응 유전자와 함께 제공되어, 5 개의 유전자를 함유하는 pMGX- 기반 시스템이 용이하게 구축되어 대장균 에서 5 가지 암호화 된 단백질 모두를 생성하는데 사용될 수 있음을 보여준다. 이 시스템em과 프로토콜을 사용하여 연구자는 대장균 에서 복잡한 다중 구성 요소 모듈과 경로를 일상적으로 표현할 수 있습니다.
서론
여러 단백질의 동시 발현은 점점 더 필수적이며, 특히 합성 생물학 분야에서 여러 기능적 모듈이 표현되어야한다. 단백질 단백질 복합체를 연구 할 때, 발현과 기능은 흔히 동시 발현 2 , 3을 필요로 한다. 경로의 각 유전자가 4 , 5 , 6 , 7 , 8 로 표현되어야하는 생합성 경로를 특성화하고 활용하는데있다. 실험실 재조합 단백질 발현을위한 작업 말인 대장균 (Escherichia coli) 에서 특히 공동 발현을위한 많은 시스템이 개발되었다. 예를 들어, 선택성 마커가 다른 여러 플라스미드를 사용하여 다양한 다른 ex 압흔 벡터들 ( 10 , 11) . 다중 단백질 발현을위한 단일 플라스미드 시스템은 각 유전자의 발현을 조절하기 위해 다중 프로모터를 사용 하였다....
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프로토콜
1. 관심 유전자 얻기
- 합성 유전자를 디자인하십시오.
- 대장균 발현을위한 유전자 서열을 최적화하십시오.
- 염기 서열 (AvrII, NdeI, EcoRI 및 XbaI)에서 문제가되는 제한 효소 부위를 제거합니다.
- 복제를위한 제한 사이트 통합; 5'-NdeI 사이트 및 3'-EcoRI 사이트가 권장된다. 필요한 경우 다른 사이트를 사용할 수 있습니다. 선택된 플라스미드의 다중 클로닝 영역을 참조하십시오 ( 그림 S1- S4 ). 원하는 경우 Western blot detection을 위해 5 '또는 3'encoding tag를 포함하십시오.
- 상업적으로 설계된 유전자를 주문하십시오.
- 제조 업체의 지시에 따라 무딘 복제 키트를 사용하여 무딘 벡터에 유전자를 무작위로 복제하십시오. 유전자를 증폭시키는 프라이머를 디자인한다 (단계 1.2.2로 진행). 또는 pMGX 플라스미드에 직접 클로닝하기 위해 추가로 5 '및 3'말단을 첨가하고 단계 2로 진행한다. 여기서, th대표적인 결과는 관심있는 유전자를 무딘 복제 한 결과입니다. ....
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결과
이 연구에서 목표는 단일 플라스미드에서 5 개의 단백질을 동시에 발현시키는 것이 었습니다. N- 또는 C- 말단 헥사 히스티딘 태그를 암호화하는 5 개 코돈 최적화 된 합성 유전자 단편은 상업적으로 구매되었다. 합성 유전자를 PCR에 의해 증폭시키고 개별적으로 PCR-blunt 벡터에 클로닝하고 서열을 결정 하였다. 폴리 시스 트론 플라스미드를 생성하기 위해, 관심있는 5 개의 유전자를 먼저 적합한 pMGX 플라스미드, pMGX-A에 클로닝 하였다. 그림 2 는 NdeI + EcoRI (2 단계 참조)로 소화 한 pMGX - A뿐만 아니라 PCRBlunt - yfg1 과 PCRBlunt - yfg2 를 보여줍니다. 처음 두 유전자를 pMGX-A로 복제하기 위해 플라스미드를 NdeI + EcoRI로 절단 하였다 ( 그림 2 ). 관심.......
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토론
복합 유전자의 동시 발현은 특히 복잡하고 다중 유전자 대사 경로 3 , 4 , 5 를 특성화하고 재구성하는 데 점점 더 필수적입니다. pMGX 시스템은 대장균 루틴 6 , 7 , 8 에서 다중 유전자 동시 발현을 만들고 다양한 연구자가 접근 할 수 있도록한다. 이 연구에서는 관심있는 5 개의 단백질이 pMGX-A를 사용하여 단일 플라스미드 시스템에서 동시에 생산되는 것으로 나타났습니다. 현재 이용 가능한 많은 동시 발현 시스템은 pET Duet 벡터와 같은 bicistronic 플라스미드를 생성하는 2 개의 유전자의 삽입만을 허용한다. 더 많은 유전자를 추가해야하는 경우 선택 가능.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회 (Natural Science and Engineering Research Council of Canada)의 지원을 받았다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Enzymes | |||
| Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England Biolabs | M0290S | |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | |
| Herculase II Fusion DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600677 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Reagents | |||
| 1 kb DNA ladder | New England Biolabs | N3232L | |
| 4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels | Bio-Rad | 456-8095 | |
| 50x | TAE Fisher Thermo Scientific | BP1332-4 | |
| Agar | Fisher Thermo Scientific | BP1423-500 | |
| Agarose | Fisher Thermo Scientific | BP160-500 | |
| Ampicilin | Sigma-Alrich | A9518-5G | |
| BL21 (DE3) 화학적으로 우수한 세포 | 사내에서 준비된 Comeptent 세포 | ||
| B-PER 박테리아 단백질 추출 시약 | Fisher Thermo Scientific | PI78243 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies | 중합효소 | |
| 겔 추출 키트 | 와 함께 제공Omega | D2500-02 | E.Z.N.A 겔 추출, VWR Cat 3 제공: CA101318-972 |
| Glycine | Fisher Thermo Scientific | BP381-1 | |
| His Tag 항체 [HRP], mAb, 마우스 | GenScript | A00612 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | EMD Millipore | WBKLS0100 | |
| IPTG | Sigma-Alrich | 15502-10G | |
| LB | Fisher Thermo Scientific | BP1426-500 | |
| 메탄올 | Fisher Thermo Scientific | A411-20 | |
| 저온 살균 인스턴트 탈지 분유 | 지역 식료품점 | No-name 식료품점 우유가 적절함 | |
| 니트로셀룰로오스 멤브레인 | Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences) | 10600007 | 멤브레인 PT 0.45 &마이크로; m 200 mm x 4 m, VWR Cat #: CA10061-086 |
| Plasmid DNA Isolation Kit | Omega | D6943-02 | E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898 |
| pMGX | Boddy Lab | Boddy Lab Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca | |
| 필요에 따라 설계 및 최적화 | |||
| 두꺼운 얼룩 여과지 | Bio-Rad | 1703932 | |
| Tris base | BioShop | TRS001.1 | |
| Tween-20 | Sigma-Alrich | P9416-50ML | |
| XL1-Blue 화학적 유능 세포 | 사내에서 준비된 Comeptent 세포 | ||
| Name | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| Equipment | |||
| BioSpectrometer | Eppendorf | RK-83600-07 | |
| Gel box - | PAGEbio-Rad | 1658005 | Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell |
| Gel Imager | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| 인큐베이터-오븐 | Fisher Thermo Scientific | 11-690-650D | Isotemp |
| 인큐베이터-셰이커 | Fisher Thermo Scientific | SHKE6000-7 | MaxQ 6000 |
| 페르소나 면도기 | Fisher Thermo Scientific | S04615 | |
| 파워 팩 | Bio-Rad | S65533Q | FB300 |
| Transilluminator | VWR International | M-10E,6W | |
| Thermocylcer | Eppendorf | Z316091 | Mastercycler Personal, Sigma |
| UV Face Shield | 18-999-4542 | ||
| Waterbath | Fisher Thermo Scientific | 15-460-2SQ | |
| Western Transfer Apparatus | Bio-Rad | 1703935 | Mini-Trans Blot Cell |
참고문헌
- Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).
- Bieniossek, C., et al. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production.<....
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재인쇄 및 허가
