の調製と評価<sup> 99メートル</sup> Tc標識三座キレートバイオ直交化学反応を用いて事前ターゲティングするため
Summary
Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.
Abstract
Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing 99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with 99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the 99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.
Introduction
99m Tc では、世界的に年1、2、3ごとに行わ億50以上の撮像法で、核医学診断に使用される支配的な放射性同位元素のまま。臨床的に使用される99m Tc での薬剤の大部分は、灌流型放射性医薬品です。 99m Tc では、ターゲティング構築物への連結を介して、特定のバイオマーカーを結合するのに向いている積極的に標的とする化合物の数は限られています。対象と99m Tc での放射性医薬品の作成は、多くの場合、目的のバイオマーカー、または同位元素の半減期と結合するターゲッティング分子の能力に99m Tc で -リガンド複合体の影響により阻害される高分子量の生体分子と共に使用するための十分な長さではありません抗体など。後者は、典型的には、画像が非標的TISSからクリアする生体分子のためのために取得されるまでに数日を要します UE。プレターゲッティングは、これらの課題を克服するための代替的なアプローチを提供しています。
バイオ直交化学と組み合わせたプレターゲッティングの両方蛍光および放射性イメージング4、5、6、7、8のための新たな分子イメージングプローブを開発するための有効な方法であることが示されています。 1,2,4,5-テトラジン（Tzの）およびトランス -cyclooctene（TCO）誘導体の間の逆電子需要ディールス-アルダー（IEDDA）反応、 図1に示すように、6特に有効であることが示されました。これらのコンポーネントとのIEDDA反応は、高選択性、in vivoでプレターゲッティングアプリケーション9、10にも最適です（2≈6000 M -1 s -1のk）をPBSに速い反応速度を示すことができます。
e_content 11 C、18 Fに基づく">使用される最も一般的なアプローチは、TCO由来ベクターを標的にし、十分な遅延期間の後、放射性標識されたテトラジンが投与さを投与することを含む。放射性標識テトラジン、64のCu、89 Zrおよび111 Inがされています11、12、13、14、15に報告された。対照的に、in vivoでの結合タンパク質および分解を防止するために、共リガンドの使用を必要とHYNIC系配位子を用いて調製したの99mのみ報告Tc標識Tzのは、あります16。別の方法として、ここでは99m Tc で （I）の合成を報告し、[99m Tc で （CO）3] +コアで安定した三座複合体を形成するリガンドのファミリーを使用して、テトラジンを標識しました。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-p年齢= "1">
図1：テトラジンとトランス -cyclooctene間のバイオ直交IEDDA反応。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
準備リガンドのファミリーは、極性および金属結合領域とTzを（ 図2）との間のリンカー基の性質に変化する三座キレートを含んでいます。目標は、結合していないときに効果的に高い標的対非標的比を得るために、局在化およびin vivoでの TCO標識部位と反応し、速やかにクリアできた99m Tc でテトラジン構築物を同定することでした。リガンドをテストするには、ビスホスホネートのTCO-誘導体（TCO-BP）が17を使用しました。私たちは、TCO-BPは、アクティブな骨代謝の領域に局在することが以前に示されているとと反応することができます生体内 18 で放射性標識されたテトラジン。それは、単一の工程で調製することができ、実験は局在が主に関節（膝、および肩）で発生する通常のマウスで行うことができるので、新たなテトラジンをテストするための便利な試薬です。
Protocol
Representative Results
Discussion
変化する極性のテトラジン結合三座キレートのコレクションを調製し、in vivoでの TCO誘導体とIEDDA反応におけるそれらの99m Tc での複合体の有用性を評価しました。効果的かつ再現性の99m Tc で標識法は、リガンド濃度はラベリング工程（化合物2-5） のt-ブチル基の脱保護を行った10 -3 Mであった。5テトラジンキレート、のため?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work supported by research grant funding from the Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada, the Ontario Institute for Cancer Research (OICR, #P.SI.015.8), and the Canadian Cancer Society (CCS, #703857). The authors acknowledge the contributions of Dr. Denis Snider who provided assistance in preparing the manuscript.
Materials
| Argon gas | Alphagaz | — | — |
| Na2CO3 | EMD Millipore | 106395 | — |
| Na2B4O7.10H2O | Anachemia | S9640 | — |
| KNaC4H4O6.4H2O | Anachemia | 217255 | — |
| Technelite 99mTc generator | Lantheus medical imaging | — | Source of 99mTcO4- |
| 0.9% Saline | Lantheus medical imaging | — | To elute generator |
| 1 M HCl | Lab Chem | — | — |
| MeOH | Caledon | — | — |
| ACN | Caledon | — | HPLC grade |
| Millipore H2O | Thermo Fisher Scientific | Barnstead Nanopure | — |
| DCM | Caledon | — | — |
| TFA | Caledon | — | — |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 1X |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | — |
| Tween80 | Sigma Aldrich | P8047 | — |
| Isoflurane | CDMV | 108737 | Supplier: Fresenius Kabi Animal Health |
| HPLC | Waters | 1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (item # 15590) | — |
| HPLC column for analysis and purification of compounds 2-4 | Phenomenex | 00G-4435-E0 | Gemini® 5 µm C18 110 Å, LC Column 250 x 4.6 mm, |
| HPLC column for analysis and purification of compounds 1 and 5 | Waters | 186003115 | XBridge BEH C18 Column, 130 Å, 5 µm, 4.6 mm X 100 mm |
| Microwave Reactor | Biotage | Initiator 8 | — |
| Biotage V10 Evaporator | Biotage | Serial # V1041 | — |
| Dose calibrator | Capintec, Inc. | CRC-25R | — |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | — |
| Animal room scale | Mettler Toledo | XP105 Delta Range | — |
| Microwave vials | Biotage | 355629 | 0.5-2 mL |
References
- Jurisson, S. S., Lydon, J. D. Potential Technetium Small Molecule Radiopharmaceuticals. Chem. Rev. 99 (9), 2205-2218 (1999).
- Kluba, C. A., Mindt, T. L. Click-to-chelate: Development of Technetium and Rhenium-Tricarbonyl Labeled Radiopharmaceuticals. Molecules. 18, 3206-3226 (2013).
- Amato, I. Nuclear Medicines Conundrum. Chem. Eng. News. 87 (36), 58-70 (2009).
- Hnatowich, D. J., Virzi, F., Rusckowski, M. Investigations of Avidin and Biotin for Imaging Applications. J. Nucl. Med. 28 (8), 1294-1302 (1987).
- Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactivity. J. Am. Chem. Soc. 130 (41), 13518-13519 (2008).
- Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Tetrazine-Based Cycloadditions: Application to Pretargeted Live Cell Imaging. Bioconjugate Chem. 19 (12), 2297-2299 (2008).
- Rossin, R., et al. In Vivo Chemistry for Pretargeted Tumor Imaging in Live Mice. Angew. Chem., Int. Ed. 49 (19), 3375-3378 (2010).
- Zeglis, B. M., et al. Optimization of a Pretargeted Strategy for the PET Imaging of Colorectal Carcinoma via the Modulation of Radioligand Pharmacokinetics. Mol. Pharmaceutics. 12 (10), 3575-3587 (2015).
- Rossin, R., et al. Highly Reactive trans-Cyclooctene Tags with Improved Stability for Diels-Alder Chemistry in Living Systems. Bioconjugate Chem. 24 (7), 1210-1217 (2013).
- Rossin, R., Robillard, M. S. Pretargeted Imaging Using Bioorthogonal Chemistry in Mice. Curr. Opin. Chem. Biol. 21, 161-169 (2014).
- Denk, C., et al. Development of a 18F-Labeled Tetrazine with Favorable Pharmacokinetics for Bioorthogonal PET Imaging. Angew. Chem., Int. Ed. 53 (36), 9655-9659 (2014).
- Herth, M. M., Andersen, V. L., Lehel, S., Madsen, J., Knudsen, G. M., Kristensen, J. L. Development of a 11C-labeled Tetrazine for Rapid Tetrazine-Trans-Cyclooctene Ligation. Chem. Commun. 49 (36), 3805-3807 (2013).
- Li, Z., et al. Tetrazine-Trans-Cyclooctene Ligation for the Rapid Construction of 18F Labeled Probes. Chem. Commun. 46 (42), 8043 (2010).
- Nichols, B., Qin, Z., Yang, J., Vera, D. R., Devaraj, N. K. 68Ga Chelating Bioorthogonal Tetrazine Polymers for the Multistep Labeling of Cancer Biomarkers. Chem. Commun. 50 (40), 5215-5217 (2014).
- Zeglis, B. M., et al. A Pretargeted PET Imaging Strategy Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. J. Nucl. Med. 54 (8), 1389-1396 (2013).
- García, M. F., et al. 99mTc-Bioorthogonal Click Chemistry Reagent for In Vivo Pretargeted Imaging. Bioorg. Med. Chem. 24 (6), 1209-1215 (2016).
- Russell, R. G. G. Bisphosphonates: The First 40 Years. Bone. 49 (1), 2-19 (2011).
- Yazdani, A., et al. A Bone-Seeking Trans-Cyclooctene for Pretargeting and Bioorthogonal Chemistry: A Proof of Concept Study Using 99mTc and 177Lu-Labeled Tetrazines. J. Med. Chem. , (2016).
- Alberto, R., et al. A Novel Organometallic Aqua Complex of Technetium for the Labeling of Biomolecules: Synthesis of [99mTc(OH2)3(CO)3]+ from [99mTcO4]- in Aqueous Solution and its Reaction with a Bifunctional Ligand. J. Am. Chem. Soc. 120 (31), 7987-7988 (1998).
- Alberto, R., Ortner, K., Wheatley, N., Schibli, R., Schubiger, A. P. Synthesis and properties of boranocarbonate: A convenient in situ CO source for the aqueous preparation of [99mTc(OH2)3(CO)3. J. Am. Chem. Soc. 123 (13), 3135-3136 (2001).
- Lu, G., et al. Synthesis and SAR of 99mTc/Re-labeled Small Molecule Prostate Specific Membrane Antigen Inhibitors with Novel Polar Chelates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1557-1563 (2013).
- Maresca, K. P., et al. Small Molecule Inhibitors of PSMA Incorporating Technetium-99m for Imaging Prostate Cancer: Effects of Chelate Design on Pharmacokinetics. Inorg. Chim. Acta. 389, 168-175 (2012).
- Bartholomä, M. D., et al. Insight into the Mode of Action of Re(CO)3 Thymidine Complexes. ChemMedChem. 5 (9), 1513-1529 (2010).
