Preparación y Evaluación de^99m Tc-etiquetados tridentado Los quelatos de orientación previa Usando Bioorthogonal Química

Summary

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate ^99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

Abstract

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing ^99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with ^99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the ^99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

Introduction

^99m Tc sigue siendo el radioisótopo más utilizado en medicina nuclear de diagnóstico, con más de 50 millones de procedimientos de imágenes realizadas por año en todo el mundo ^{1, 2, 3.} La mayoría de los agentes de Tc ^99m usados clínicamente son de tipo perfusión radiofármacos. Hay un número limitado de compuestos dirigidos activamente en la que ^99m Tc se dirige para unir un marcador biológico específico a través de la ligación a un constructo de reconocimiento. La creación de ^99m dirigida radiofármacos Tc es a menudo dificultada por la influencia de ^99m complejos de Tc-ligando en la capacidad de la molécula de direccionamiento de obligar a la biomarcador de interés, o los isótopos de vida media no es lo suficientemente largo para su uso con biomoléculas de mayor peso molecular tales como anticuerpos. Este último requiere típicamente varios días antes de las imágenes se adquieren a fin de que la biomolécula para borrar de no diana tiss UES. Pre-focalización ofrece un enfoque alternativo para superar estos desafíos.

Pre-orientación combinada con la química bioorthogonal ha demostrado ser una forma eficaz para desarrollar nuevas sondas de imagen molecular tanto para fluorescencia y radio-formación de imágenes ^{4, 5, 6, 7, 8.} La reacción de la demanda de electrones inversa Diels-Alder (IEDDA) entre 1,2,4,5-tetrazina (Tz) y derivados -cyclooctene trans (TCO), tal como se muestra en la Figura 1, ha demostrado ser particularmente eficaz ^6. La reacción IEDDA con estos componentes puede exhibir cinética rápida en PBS ₍₂ k ≈ 6.000 M ^-1 s ^-1) y una alta selectividad, por lo que es ideal para in vivo de orientación previa aplicaciones ^{9, 10.}

e_content "> El enfoque más común utilizado implica la administración de un vector de orientación TCO-derivado y después de un período de retardo suficiente, se administra una tetrazina radiomarcado. tetrazinas radiomarcados basado en ¹¹ C, ¹⁸ F, ⁶⁴ Cu, ⁸⁹ Zr, y ¹¹¹ En haber sido reportado ^{11, 12, 13, 14, 15.} por el contrario, sólo hay un informe de un marcado ^{con 99mTc} Tz, que se preparó usando un ligando de tipo HYNIC requerir el uso de co-ligandos para prevenir la unión a proteínas y la degradación in vivo ^16. Como alternativa, se presenta aquí la síntesis de ^99m Tc (I) marcado tetrazinas usando una familia de ligandos que forman complejos estables con un tridentados ^[99m Tc (CO) _3] ⁺ núcleo.

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Figura 1: La reacción entre IEDDA bioorthogonal tetrazina y -cyclooctene trans. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La familia de ligandos preparadas contienen quelatos tridentados que varían en la polaridad y la naturaleza del grupo de enlace entre la región de unión de metal y el Tz (Figura 2). El objetivo fue identificar una ^Tc-99m tetrazina constructo que podría localizar y reaccionar con los sitios marcados con TCO en vivo y rápidamente claro cuando no estén unidas de manera efectiva, a fin de producir alta objetivo a no objetivo proporciones. Para probar los ligandos, se utilizó un TCO-derivado de un bisfosfonato (TCO-BP) ^17. Hemos demostrado previamente que el TCO-BP se localiza en áreas de metabolismo óseo activo y puede reaccionar contetrazinas radiomarcados en vivo ^18. Es un reactivo conveniente para probar nuevos tetrazinas, ya que se puede preparar en un solo paso y los experimentos se puede realizar en los ratones normales, donde la localización se produce principalmente en las articulaciones (rodillas y hombros).

Protocol

Los estudios con animales fueron aprobados por el Consejo de Ética de Experimentación Animal de la Universidad McMaster, de acuerdo con el Consejo Canadiense de Protección de los Animales (CCPA) directrices. 1. El radiomarcado de ligandos Tz-tridentado con 99m Tc PRECAUCIÓN: Los siguientes procedimientos requieren el uso de compuestos radiactivos. El trabajo sólo debe hacerse en un laboratorio autorizado con el cumplimiento de las normas de s…

Representative Results

Los ligandos se sintetizaron utilizando diferentes enlazadores y quelantes a través de una simple estrategia de aminación reductora (Figura 2), seguido de acoplamiento del producto a un tetrazina disponible en el mercado 22, 23. El radiomarcado se realizó utilizando el mismo método para todos los compuestos y era altamente reproducible. El proceso se ha optimizado variando el pH, la cantidad de ligando, tiemp…

Discussion

Se preparó una colección de quelatos tridentado tetrazina ligados de distintas polaridades, y se evaluó la utilidad de sus complejos ^99m Tc en la reacción con un derivado IEDDA TCO in vivo. Un método eficaz y reproducible ^99m Tc fue desarrollado para cinco tetrazina quelatos, donde la concentración de ligando se 10 ^-3 M. La etapa de marcaje fue seguido por la desprotección de t- butilo (para los compuestos 2-5). La alta concentración de ligando …

Materials

Argon gas	Alphagaz	—	—
Na2CO3	EMD Millipore	106395	—
Na2B4O7.10H2O	Anachemia	S9640	—
KNaC4H4O6.4H2O	Anachemia	217255	—
Technelite 99mTc generator	Lantheus medical imaging	—	Source of 99mTcO4-
0.9% Saline	Lantheus medical imaging	—	To elute generator
1 M HCl	Lab Chem	—	—
MeOH	Caledon	—	—
ACN	Caledon	—	HPLC grade
Millipore H2O	Thermo Fisher Scientific	Barnstead Nanopure	—
DCM	Caledon	—	—
TFA	Caledon	—	—
PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023	pH 7.4 1X
BSA	Sigma Aldrich	A7906	—
Tween80	Sigma Aldrich	P8047	—
Isoflurane	CDMV	108737	Supplier: Fresenius Kabi Animal Health
HPLC	Waters	1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (item # 15590)	—
HPLC column for analysis and purification of compounds 2-4	Phenomenex	00G-4435-E0	Gemini® 5 µm C18 110 Å, LC Column 250 x 4.6 mm,
HPLC column for analysis and purification of compounds 1 and 5	Waters	186003115	XBridge BEH C18 Column, 130 Å, 5 µm, 4.6 mm X 100 mm
Microwave Reactor	Biotage	Initiator 8	—
Biotage V10 Evaporator	Biotage	Serial # V1041	—
Dose calibrator	Capintec, Inc.	CRC-25R	—
Gamma counter	Perkin Elmer	Wizard 1470 Automatic Gamma Counter	—
Animal room scale	Mettler Toledo	XP105 Delta Range	—
Microwave vials	Biotage	355629	0.5-2 mL