Udarbejdelse og evaluering af^99m Tc-mærket tridentat Chelater for Pre-targeting Brug Bioorthogonal Kemi

Summary

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate ^99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

Abstract

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing ^99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with ^99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the ^99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

Introduction

^99mTc er fortsat den dominerende radioisotop anvendes i diagnostiske nuklearmedicin, med over 50 millioner billeddannende procedurer udført om året på verdensplan ^{1, 2, 3.} Størstedelen af ^99m Tc midler anvendt klinisk er perfusion typen radioaktive lægemidler. Der er et begrænset antal aktivt målrettede forbindelser, hvor ^99mTc angår binde en specifik biomarkør gennem ligering til en targeting konstrukt. Oprettelsen af målrettet ^99m Tc radioaktive lægemidler er ofte hæmmet af påvirkning af ^99m Tc-ligand komplekser på evne til at målrette molekyle til at binde biomarkør af interesse, eller de isotoper halveringstid er ikke lang nok til brug med højere molekylvægt biomolekyler såsom antistoffer. Sidstnævnte kræver typisk flere dage før billederne er erhvervet, for at biomolekyle at rydde fra ikke-target tiss dier. Pre-targeting tilbyder en alternativ tilgang til at overvinde disse udfordringer.

Pre-targeting kombineret med bioorthogonal kemi har vist sig at være en effektiv måde at udvikle nye molekylære billeddannende prober for både fluorescens og radio-imaging ^{4, 5, 6, 7, 8.} Den inverse elektron efterspørgsel Diels-Alder (IEDDA) reaktion mellem 1,2,4,5-tetrazin (Tz) og trans -cyclooctene (TCO) derivater, som vist i figur 1, har vist sig at være særligt effektive ^6. Den IEDDA reaktion med disse komponenter kan udvise hurtige kinetik i PBS (k ₂ ≈ 6000 M ^-1 s ^-1) og høj selektivitet, hvilket gør den ideel til in vivo pre-målretning applikationer ^{9, 10.}

e_content "> Den mest almindelige anvendte metode involverer administration en vektor TCO-afledt målrette og efter en tilstrækkelig forsinkelse periode, er en radioaktivt mærket tetrazin administreret. Radiomærkede tetraziner baseret på ¹¹ C, ¹⁸ F, ⁶⁴ Cu, ⁸⁹ Zr, og ¹¹¹ I har været rapporterede ^{11, 12, 13, 14, 15.} i modsætning hertil er der kun én rapport af en ^{99mTc-mærket} Tz, der blev fremstillet under anvendelse af en HYNIC typen ligand kræver brug af co-ligander at forhindre proteinbinding og nedbrydning in vivo ^16. som et alternativ, rapporterer vi her syntese af ^99m Tc (i) mærket tetraziner anvendelse af en familie af ligander, som danner stabile tridentate komplekser med et ^[99mTc (CO) _3] ⁺ kerne.

<p class="jove_content" fo:keep-together.within-palder = "1">
Figur 1: Den bioorthogonal IEDDA reaktion mellem tetrazin og trans -cyclooctene. Klik her for at se en større version af dette tal.

Familien af ligander fremstillet indeholder tridentate chelater, der varierer i polaritet og arten af linkergruppen mellem metallet bindende region og Tz (figur 2). Målet var at identificere en ^{99mTc-tetrazin} konstruere, der effektivt kunne lokalisere og reagere med TCO-mærkede steder in vivo og hurtigt klart, når der ikke er bundet, med henblik på at give høj target-til-ikke-mål-forhold. For at teste liganderne blev en TCO-derivat af et bisphosphonat (TCO-BP) anvendt ^17. Vi har tidligere vist, at TCO-BP lokaliseres til områder med aktiv knoglemetabolisme og kan reagere medradiomærkede tetraziner in vivo ^18. Det er et praktisk reagens at teste nye tetraziner, fordi det kan fremstilles i et enkelt trin og kan udføres forsøg i normale mus, hvor lokalisering forekommer primært i leddene (knæ og skuldre).

Protocol

Dyreforsøg blev godkendt af Animal Research Ethics Board ved McMaster University i overensstemmelse med canadisk Råd om Animal Care (CCAC) retningslinjer. 1. Radiomærkning af Tz-tridentatligander med 99mTc ADVARSEL: Følgende procedurer kræver anvendelse af radioaktive forbindelser. Arbejdet bør kun ske i et godkendt laboratorium med overholdelse af sikkerheds- og bortskaffelse regler. Mikroovn reaktioner bør udføres i en mikrobølgeovn er …

Representative Results

Liganderne blev syntetiseret under anvendelse af forskellige linkere og chelatorer via en simpel reduktiv aminering strategi (figur 2), efterfulgt af kobling af produktet med en kommercielt tilgængelig tetrazin 22, 23. Radiomærkning blev udført under anvendelse af den samme fremgangsmåde for alle forbindelser og var meget reproducerbar. Processen blev optimeret ved at variere pH, mængden af ligand, reaktions…

Discussion

En samling af tetrazin-linked tridentate chelater af varierende polariteter blev fremstillet, og anvendeligheden af deres ^99m Tc komplekser i IEDDA reaktion med et TCO derivat in vivo blev vurderet. En effektiv og reproducerbar ^99mTc mærkning metode er udviklet til fem tetrazin-chelater, hvor ligandkoncentrationen var 10 ^-3 M. Trinnet mærkning blev efterfulgt af afbeskyttelse af t- butylgrupper (for forbindelser 2-5). Den høje koncentration af ligand…

Materials

Argon gas	Alphagaz	—	—
Na2CO3	EMD Millipore	106395	—
Na2B4O7.10H2O	Anachemia	S9640	—
KNaC4H4O6.4H2O	Anachemia	217255	—
Technelite 99mTc generator	Lantheus medical imaging	—	Source of 99mTcO4-
0.9% Saline	Lantheus medical imaging	—	To elute generator
1 M HCl	Lab Chem	—	—
MeOH	Caledon	—	—
ACN	Caledon	—	HPLC grade
Millipore H2O	Thermo Fisher Scientific	Barnstead Nanopure	—
DCM	Caledon	—	—
TFA	Caledon	—	—
PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023	pH 7.4 1X
BSA	Sigma Aldrich	A7906	—
Tween80	Sigma Aldrich	P8047	—
Isoflurane	CDMV	108737	Supplier: Fresenius Kabi Animal Health
HPLC	Waters	1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (item # 15590)	—
HPLC column for analysis and purification of compounds 2-4	Phenomenex	00G-4435-E0	Gemini® 5 µm C18 110 Å, LC Column 250 x 4.6 mm,
HPLC column for analysis and purification of compounds 1 and 5	Waters	186003115	XBridge BEH C18 Column, 130 Å, 5 µm, 4.6 mm X 100 mm
Microwave Reactor	Biotage	Initiator 8	—
Biotage V10 Evaporator	Biotage	Serial # V1041	—
Dose calibrator	Capintec, Inc.	CRC-25R	—
Gamma counter	Perkin Elmer	Wizard 1470 Automatic Gamma Counter	—
Animal room scale	Mettler Toledo	XP105 Delta Range	—
Microwave vials	Biotage	355629	0.5-2 mL