To distinguish cell division from cell cycle variations in cardiomyocytes, we present protocols using two transgenic mouse lines: Myh6-H2B-mCh transgenic mice, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and CAG-eGFP-anillin mice, for distinguishing cell division from cell cycle variations.
Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and cytokinesis) and acytokinetic mitosis (karyokinesis but no cytokinesis). Such atypical cell cycle variations result in polyploid and multinucleated cells rather than in cell division. Therefore, to determine cardiac turnover and regeneration, it is of crucial importance to correctly identify cardiomyocyte nuclei, the number of nuclei per cell, and their cell cycle status. This is especially true for the use of nuclear markers for identifying cell cycle activity, such as thymidine analogues Ki-67, PCNA, or pHH3. Here, we present methods for recognizing cardiomyocytes and their nuclearity and for determining their cell cycle activity. We use two published transgenic systems: the Myh6-H2B-mCh transgenic mouse line, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and the CAG-eGFP-anillin mouse line, for distinguishing cell division from cell cycle variations. Combined together, these two systems ease the study of cardiac regeneration and plasticity.
cardiomyocyte नाभिक और कोशिका चक्र स्थिति की सही पहचान के हृदय की मांसपेशी कारोबार और उत्थान के निर्धारण के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है। इस तरह के pHH3, की-67, या Thymidine analogs के रूप में परमाणु मार्कर, कोशिका चक्र गतिविधि की पहचान करने के लिए, के उपयोग के लिए विशेष रूप से सच है। के रूप में वयस्क स्तनधारी cardiomyocytes के proliferative क्षमता बहुत छोटी सी 1, एक नाभिक एक cardiomyocyte नाभिक के प्रसार मार्कर प्रसार परख के परिणाम में एक महत्वपूर्ण अंतर कर सकता है के लिए सकारात्मक का एक झूठी पहचान है। इसके अलावा, इस तरह के cardiomyocytes endoreduplication और acytokinetic बँटवारा के रूप में सेल चक्र में बदलाव, जो polyploid और multinucleated कोशिकाओं में बजाय कोशिका विभाजन में परिणाम की संभावना है। यह अंत करने के लिए, आम सेल चक्र मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी धुंधला की व्याख्या के सभी मामलों में निर्णायक नहीं है।
यहाँ, हम सीधे-forwa के लिए तरीके प्रस्तुत माउस cardiomyocytes के आरडी मान्यता और उनके नाभिक की स्पष्ट पहचान के द्वारा प्रसव के बाद और वयस्क चरणों में देशी अलग कक्षों और मोटी ऊतक वर्गों में उनकी nuclearity। उस प्रयोजन के लिए, एक संलयन Myh6 प्रमोटर (Myh6-H2B-एमसीएच) के नियंत्रण में मानव हिस्टोन H2B और mCherry से मिलकर प्रोटीन की cardiomyocyte विशिष्ट अभिव्यक्ति के साथ एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन 2 इस्तेमाल किया गया था। एक ट्रांसजेनिक प्रसार सूचक माउस लाइन के साथ इस माउस लाइन, जिसमें एक EGFP-anillin संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति एक सीएमवी बढ़ाने के साथ सर्वव्यापी चिकन actin प्रमोटर के नियंत्रण में है क्रॉस-प्रजनन (सीएजी-EGFP-anillin), के लिए अनुमति देता है सेल चक्र स्थिति का निर्धारण। मचान प्रोटीन anillin विशेष रूप से सक्रिय कोशिकाओं 3 सेल चक्र में व्यक्त किया जाता है, और सेल चक्र के दौरान अपने अंतर subcellular स्थानीयकरण एम चरण के एक उच्च संकल्प के साथ लाइव-ट्रैकिंग सेल चक्र प्रगति के लिए अनुमति देता हैएफई "> 4। इसलिए, डबल ट्रांसजेनिक चूहों proliferating cardiomyocytes और उन है कि सेल चक्र से गुजरना रूपों के बीच भेदभाव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह इन विट्रो में प्रसार उत्प्रेरण पदार्थों के लिए स्क्रीनिंग में विशेष रूप से उपयोगी साबित होता है।
वहाँ पर कि क्या cardiomyocytes कोशिका चक्र फिर से दर्ज है और चोट के बाद और ऊतक homeostasis दौरान विभाजित करने में सक्षम हैं एक विवाद है। Cardiomyocytes के बुनियादी कारोबार के लिए मान 1% 1 और 80% से 7 के बीच सीमा में दी ?…
The authors have nothing to disclose.
We thank S. Grünberg (Bonn, Germany) and P. Freitag (Bonn, Germany) for their technical assistance.
10 cm petri dish | Sarstedt | 821472 | |
100 µm cell strainer | Becton Dickinson GmbH/Falcon | 352360 | |
2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
G20x1 ½ injection cannula, Sterican | Braun, Melsungen | 4657519 | |
20 gauge needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | |
24-well plates | Becton Dickinson GmbH/Falcon | 353047 | |
2-Methyl-butane | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3927.1 | |
37% formaldehyde solution | AppliChem GmbH | A0936,1000 | |
3-way stopcock | B. Braun Medical Inc. | 16494C | |
50 ml syringe | B. Braun Medical Inc. | 8728810F | |
70% ethanol | Otto Fischar GmbH | 27669 | |
Alexa-Fluor-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-605-205 | |
Alpha-Aktinin EA-53, Mouse IgG | Sigma-Aldrich, Steinheim | A7811 | |
CaCl | Sigma-Aldrich | C4901 | |
Cell Culture Microplate, 96 Well, Half Area | Greiner bio-one | 675986 | |
Collagenase B | Roche | 11088815001 | |
confocal microscope Eclipse Ti-E | Nikon | ||
cryostat CM 3050S | Leica | ||
donkey serum | Jackson Immuno Research, Suffolk, GB | 017-000-121 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
fetal calf serum | PromoCell, Heidelberg | ||
Formaldehyde solution (4%) | PanReac AppliChem | A3697 | |
Gelatine from porcine skin, Type A | Sigma-Aldrich, Steinheim | G2500 | |
glass coverslips | VWR | 631-0146 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
Heidelberger extension tube | IMPROMEDIFORM GmbH | MF 1833 | |
Heparin-Natrium | Ratiopharm | 5394.02.00 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
HistoBond microscope slides | Marienfeld | 0810000 | |
Hoechst 33342 (1mg/ml) | Sigma Aldrich, Taufkirchen | B2261 | |
Insulin syringe | Becton Dickinson GmbH | 300334 | |
Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco/Life Technologies, Darmstadt | 21980-032 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
Laminin | Corning | 354221 | |
Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti | Nikoninstruments, Düsseldorf | ||
Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt | 13778075 | |
Mouse IgG Cy5 (donkey) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | |
MGCl | Sigma-Aldrich | M8266 | |
microcentrifuge tube | Sarstedt | 72690 | |
Mini shaker | VWR | 12620-940 | |
mirVana miRNA mimic, hsa-miR199a-3p | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4464066 | |
Biopsy Mold | Sakura Finetek/ VWR | 4565 | |
M-slide 8-well ibiTreat | ibidi | 80826 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
NaOH | Merck Millipore | 567530 | |
negative control(scrambled RNA) | Ambion/Thermo Fischer Scientific | AM4611 | |
Neonatal Heart Dissociation Kit | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach | 130-098-373 | |
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit | Nikoninstruments, Düsseldorf | ||
Non essential amino acids, NEAA | Gibco/Life Technologies, Darmstad | 11140-035 | |
Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco | 51985-026 | |
P21-siRNA | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4390771 | |
P27-siRNA | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4390771 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco/Life Technologies, Darmstadt | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Steinheim | 14190-094 | |
Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading | Sigma-Aldrich | 10981 | |
RNase A | Qiagen | 1007885 | |
RNaseZap | Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt | AM9780 | |
sample containers | Vitlab | 80731 | |
Serological pipette | Greiner | 607180 | |
software NIS Elements | Nikon | ||
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek/ VWR | 25608-930 | |
ToPro3 iodide (642/661) | Molecular probes/ThermoFisher Scientific | T3605 | |
Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Triton X | Fluka | 93418 | |
Triton X-100 | Fluka | 93418 | |
Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
Wheat germ agglutinine (WGA) Fluorescein labeled | Vector Laboratories | VEC-FL-1021-5 | |
α-actinin antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | |
β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Steinheim | M3148 |