이 프로토콜은 마우스의 피부에 벌거 벗은 플라스미드 DNA를 표현하기위한 비용 효율적인 대안이다. 프로토콜의 전반적인 목표는 피부 염증의 특정 유전자의 기능적 역할을 묘사하기 위해 피부 조직에 면역 관련 유전자를 제공하는 것입니다.
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이 논문에서
요약
초록
피부 면역 반응의 조절 장애는 수많은 인간의 피부 질환과 연관되어 있습니다. 피부 조직에 면역 관련 유전자의 직접 전송은 인간의 질병의 마우스 모델에서 피부 염증의 면역 변조를 조사 할 수있는 매력적인 방법입니다. 여기에서 우리는 마우스의 피부에 벌거 벗은 DNA를 전달 유전자 발현에 이르게 비용 효율적인 프로토콜을 제시한다. 상기 방법은 천공 ACU 매개 DNA 트랜스 fection를 나타내는 "acufection"를 만들어 낸된다. acufection을 수행하려면 마우스 피부 제 인산 완충 용액 (PBS)에 DNA 주입 후 세포 내로의 DNA 및 형질 흡수를 용이하게 침 다발로 가볍게 찔러 하였다. 플라스미드 DNA는 아마도 각화 세포 및 피부의 수지상 세포에 의해 용해 단백질로 발현된다. 바늘 자체와 기계 녀석은 피부 손상을 일으키거나 각질 세포의 활성화를 유도하지 않았다. 표현형질 전환 된 유전자의 2 일간 acufection 다음 전사 및 번역 모두 수준에서 피부에서 발견 된 7 일까지 유지했다. 이 acufection 방법의 개발에 주 목적은 IL-15의 미리 정의 이성체를 조사 하였다. 염증을 유도하기 위해, 피부에 표현하고이어서 수신자 같은 수용체 7 (TLR7) 작용제, 이미 퀴 모드 (IMQ) 처리이있어서, 부분적으로 삭제 엑손 7 (IL-15ΔE7)와 다르게 스 플라이 싱 된 IL-15 이성체이었다 사용. Acufection-전달 피부는 IL-15ΔE7 IMQ 유도 된 피부 염증의 각질 세포 증식, 상피 두께 및 호중구 모집을 억제 하였다. 피부 염증의 조절기구를 식별하는 관심이 증가함에 따라, 프로토콜은 여기에 기재된 생체 내에서 DNA 전달을위한 유전자 총 시스템 또는 microseeding에 비용 효과적인 다목적의 대안을 제공한다. 잠재적으로 새로운 기능의 검색을 허용 할 수있다피부 또는 피부 질환에 대한 새로운 치료법을 조사하는 유전자.
서론
피부 숙주 방어의 첫 번째 라인이다. 각질 세포 (KCS)는 인간과 쥐의 피부의 주요 세포 유형입니다. 환경 적 자극 (예를 들면 태양 광, 산소, 화학 물질 및 병원균 침입)에 응답하여, 관세청 활성화 및 IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF-α과 같은 염증성 사이토 카인 및 케모카인의 다양한 생산되고 α 및 GM-CSF 1. 이들은 피부에 면역 세포의 채용을 트리거합니다. 악화되는 피부 염증은 종종 급성 자궁외 접촉 피부염 및 만성 T 세포 매개 성 염증 (예를 들어 알레르기 성 접촉 피부염 및 건선) 2 등 다양한 인간 질병과 연관되어 있습니다. KC 활성화를 억제함으로써 피부의 염증 반응을 조절하는 것은 피부 염증을 치료하는 그럴듯한 방법입니다. 이 프로토콜은 일시적으로 면역 고해상도를 연구하기 위해 표피에서 사이토 카인 유전자를 표현하는 새로운 접근 방식을 설명합니다피부에 이러한 치료에 결과적 ponse.
표피는 피부의 가장 표층을 구성한다. 그러한 피부의 심층 들어가는 병원체 핵산과 같은 외부 물질을 유지하는 물리 장벽으로서 기능한다. 여러 바늘없는 기술은 표피 DNA 전달
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프로토콜
8에서 여성 마우스 - 연령 12 주 본 연구에 사용되었다. C57 / BL6 야생 - 타입 (WT)와 결핍 IL-15 (IL15 - / -) 마우스는 각각 국립 실험 동물 센터 (NLAC), 대만, 타 코닉 농장에서 구입 하였다. IL15 +/- 이형의 단면으로부터 제 3 세대의 비율 결핍 IL-15 (IL15 - - /) 및 IL-15을 보이면서 (+/- IL15 및 IL15은 + / +) 1을 나타내었다. IL15의 유전자형 - / - 생쥐는 PCR 분석에 의해 확인 하였다. 마우스는 실험 동물 센터 (LAC), 국립 대만 대학교 의학 (NTU) 대학에서 특정 병원체 무료 (SPF) 시설에서 유지되었다. 마취 대상 및 방법을 포함한 모든 동물의 절차는 공중 보건 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) (동물 프로토콜 20130225 승인의 진술서)의 국립 대만 대학 의과 대학 및 대학의 승인 동물 프로토콜에 따라 수행되었다.
1. 침의 제조
참고 : 침술 바늘은 핸들과 바늘 끝 (그림 1A)로 구....
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결과
일부 붉은 침술 바늘로 찌르는 후 첫 시간 이내에 분명 동안, 피부는 하루 2 지워지고 7 일까지 불리한 피부 반응 (그림 2A)를 따끔 따끔 후 관찰되지 않았다. 바늘 찌름 미처리 피부 (도 2b)과 비교하여 H & E 분석 표피 orthokeratosis 최소한의 피부 침투를 매우 낮은 수준의 유도. 표피 두께 (도 2C) 및 Ki67 + 세포 수 (도 2d)는 그 침 바늘이 꽂힌 피부 표피에 띄는 조직 파쇄 또는 세포 증식을 일으키지 않았다 보여주는 바늘이 꽂힌 미처리 피부와 비슷 하였다. 침과 CXCL 케모카인의 발현 유도의 감소 레벨을 샤프트 주사기 바늘에 비해 (직경 1.067 mm) 12.......
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토론
acufected 플라스미드 DNA의 발현을 확인하기 위해 가장 중요한 단계는 균일 진동과 피부의 각질층을 느슨하게한다. 피부를 절단하지 않고 부드럽게 바늘을 누르는 동안, 힘이 표면을 누르기 힘든 충분해야한다. 1cm X 1cm의 면적에 10 μL의 용액에서 DNA의 흡수를 용이하게하기 위해, 바늘은 30 초에 100 회 상하 진동을한다. 하나는 피부를 찌를 필요가 힘을 결정하고 acufected 유전자의 최고 발현 수준을 산출하기 위해 필요한 횟수를 주목하여 할 수 있습니다.
플라스미드 DNA의 양에 대한 수정은 상이한 유전자에 따라 달라질 수 있기 때문에 acufection가 필요함 후 발현의 만족스러운 수준에 도달하기 위해 적용 하였다. 적정 실험은 플라스미드 DNA의 최적 량은 물론, 실험 전에 적용되도록 결정하도록 수행되어야한다. 정량적 RT-PCR 분석의 결과는 O를 결정하는 데 도움이 될 것입니다플라스미드 DNA의 양 ptimal하고 재현 가능한 결과를 얻기 위.......
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공개 사항
저자는 공개 재정적 이해에는이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 과학 기술부에서 부여에 의해 지원되었다 (MOST 103-2633-B-002-002; 104-2320-B-002-048). 우리는 박사 감사합니다. 원고를 읽기위한 베티 우 셰 행정 원장과 하와이 대학에서 스탠포드 대학 박사 피터 호프만에서 NTU에 치엔 쿠오 리, 리 저보니, 농업 생명 공학의 기술 지원 NTU에서 윤 치엔 박사 웬 - 치 웨이 기술 자문에 대한 중앙 연구원에서 연구 센터.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
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| Accu 핸디 니들 | Accu | 36Gx0.5 | 의료 기기 |
| NairTM 로션 | 교회 & 드와이트 | N/A | 탈모에 사용 |
| Shandon Xyline 대체품 | Thermo Fisher Scientific | 6764506 | Deparaffinization |
| Avertin (2,2,2-Tribromethanol) | Sigma-Aldrich | T4,840-2 | Anesthesia |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Avertin |
| DifcoTM LB broth, Miller | BD 용해용 용매 | 244620 | 분자생물학을 위한 E. coli의 번식 및 유지 |
| 마우스 IL-15/IL-15R 복합체 ELISA Ready-SET-Go 키트 | eBioscience | 88-7215 | IL-15 단백질 |
| 측정 Anti-mouse Ly6G | BioLegend | 127601 | 면역조직화학 염색에 사용되는 항체 |
| Anti-mouse Ki-67 | eBioscience | 14-5698-80 | 항체 면역조직화학 염색 |
| 단순 염색 마우스 MAXPO(쥐) | Nichirei Biosciences | 414341F | 마우스 온 마우스 염색에서 백그라운드 신호를 차단하는 시약 |
| DAB 과산화효소(HRP) 기판 키트 | Vector Laboratories | SK-4100 | 면역조직화학 염색용 과산화효소 기질 |
| Ultra V 블록 | Thermo Fisher Scientific | TA-060-UB | 비특이적 배경 염색 감소 |
| 메틸 그린 | Sigma-Aldrich | M8884 | 핵 염색 |
| Vecta MountTM | Vector Laboratories | M-5000 | 영구 보존 조직 화학 염색 |
| 프로테아제 억제제 칵테일 정제 | Roche | 04-693-116-001 | 세포 용해물에서 프로테아제 활성을 억제 |
| Aldara 크림 | 3M Parmaceuticals | N/A | 5% imiquimod 크림 |
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| ABI7900HT cycler | Thermo Fisher Scientific | N/A | 정량적 real-time PCR 분석 |
| 캠코더 | Panasonic | HDC-SD60 | 이미지 문서 |
| Axio Scope.A1 | ZEISS | N/A | 명시야 현미경 검사 |
참고문헌
- Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses. Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews....
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