Summary

Desarrollo de un sistema de entrega de ADN económico por "Acufection" y su aplicación a la investigación de la piel

Published: April 19, 2017
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Summary

Este protocolo es una alternativa rentable para expresar ADN plasmídico desnudo en la piel del ratón. El objetivo general del protocolo es para suministrar genes relacionados con la inmunidad en el tejido de la piel para delinear el papel funcional de un gen específico en la inflamación cutánea.

Abstract

La desregulación de la respuesta inmune en la piel se asocia con numerosos trastornos de la piel humanos. La transferencia directa de genes relacionados con la inmunidad en el tejido de la piel es un enfoque fascinante para investigar la modulación inmune de la inflamación cutánea en modelos de ratón de enfermedades humanas. Aquí se presenta un protocolo rentable que entregó ADN desnudo en la piel del ratón y conduce a la expresión del transgen. El método se acuñó "acufection", que denota acu ADN punción mediada fection trans. Para realizar acufection, la piel del ratón se infundió primero con el ADN en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego se pincha ligeramente con un manojo de agujas de acupuntura para facilitar la absorción de ADN y transfección en células. El ADN plásmido se presumiblemente tomado por el queratinocito y las células dendríticas (DC) en la piel y se expresó en una proteína. Pinchazo mecánico con la agujas per se no causa daños en la piel o inducir la activación de los queratinocitos. La expresionde los genes transfectados se detectó en la piel, tanto a nivel de transcripción y traducción siguientes acufection durante 2 días y se mantuvo hasta 7 días. El objetivo principal para el desarrollo de este método acufection fue investigar una isoforma antes delimitada IL-15. Usando este método, un corte y empalme alternativo de IL-15 isoforma con parcialmente suprimido el exón 7 (IL-15ΔE7) se expresó en la piel y, posteriormente, tratado con un receptor de tipo Toll 7 (TLR7) agonista, imiquimod (IMQ), para inducir la inflamación. Acufection-entregado IL-15ΔE7 en la piel suprime la proliferación de queratinocitos, espesor de la epidermis y el reclutamiento de neutrófilos en la inflamación cutánea inducida por IMQ. Con el aumento de interés en la identificación de los mecanismos de regulación de la inflamación cutánea, el protocolo descrito aquí proporciona una alternativa eficaz y versátil costo para el sistema de pistola de genes o microsiembra para la entrega de ADN in vivo. Puede que potencialmente permitir el descubrimiento de la función de una novelagen en la piel o para la investigación de nuevos tratamientos para las enfermedades cutáneas.

Introduction

La piel es la primera línea de defensa del huésped. Los queratinocitos (KCS) son el principal tipo de células en la piel de los seres humanos y ratones. En respuesta a estímulos ambientales (por ejemplo la luz solar, oxígeno, productos químicos y la invasión patógena), KCS se activan y producen una amplia gama de citoquinas proinflamatorias y quimiocinas tales como IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF α y GM-CSF 1. Juntos desencadenan el reclutamiento de células inmunes en la piel. Inflamación cutánea agravado a menudo se asocia con numerosas enfermedades humanas, incluyendo la dermatitis de contacto ectópico aguda y la inflamación mediada por células T crónico (por ejemplo, dermatitis de contacto alérgica y psoriasis) 2. Modulación de las respuestas proinflamatorias en la piel inhibiendo la activación KC es un enfoque plausibles para tratar la inflamación cutánea. Este protocolo describe un nuevo enfoque para expresar transitoriamente un gen de citoquina en la epidermis con el fin de estudiar res inmunesPonse como consecuencia de un tratamiento de este tipo en la piel.

La epidermis se compone la capa más superficial de la piel. Sirve como una barrera física de mantenimiento de sustancias externas tales como ácidos nucleicos y patógenos entren en las capas más profundas de la piel. Varias técnicas libres de agujas han sido establecidos para la transferencia de ADN epidérmico 3, 4. ADN en solución o asociado con liposomas catiónicos o los vectores de adenovirus se ha aplicado directamente a la epidermis modificados con técnicas tales como la eliminación de la capa córnea o el tratamiento con depilación reactivo. La eliminación del epitelio cornified facilita ADN de cruzar la barrera epidérmica y la interacción con los queratinocitos y células de Langerhans para inducir respuestas inmunes 5. Mientras que una gran área de superficie está disponible para la transferencia de ADN y este enfoque no implica agujas, hay desventajas, incluyendo el requisitopara las grandes cantidades de ADN (10 – 100 mg), el tratamiento dura en la piel mediante separación por arrastre, y los resultados inconsistentes en la inducción de respuesta inmune en los animales inmunizados sin refuerzo suministro de ADN 6. La administración intracelular de micropartículas mediada de ADN desnudo para la piel se ha demostrado ser altamente eficiente y reproducible para la inducción de respuesta inmune 7, 8. Una pistola de genes de mano se ha utilizado para bombardear el sitio diana de la piel con el plásmido partículas de oro recubiertas de ADN 2 micras de diámetro de tamaño por medio de flujo de aire de helio presurizado 9. El ADN plásmido se presumiblemente captado por las células dendríticas (DCs) KCsand en la piel y la proteína se expresa de forma local o siendo transportado a ganglios linfáticos de drenaje por DCs 10. Aunque el sistema de pistola de genes es simple y requiere experiencia técnica limitada, el costo para la preparación y la entrega de los "bul de ADNdejar "(es decir, polvos de oro, gas helio) y para la pistola de genes se ha limitado su aplicación general. Además, el requisito de un sistema de suministro de gas helio limita la facilidad de transporte pistola de genes cuando los experimentos se llevan a cabo en diferentes lugares. microsiembra se ha demostrado que se obtiene una mayor eficiencia de la transferencia de genes de una sola inyección y el bombardeo de partículas 11. microsiembra utiliza una pistola de tatuaje para administrar ADN a la piel sin el uso de perlas de partículas 11. oscilante las microagujas en la piel usando este enfoque es probable que raspar directamente la membrana celular y por lo tanto la transferencia de ADN a múltiples células al mismo tiempo. Sin embargo, el dolor asociado con el gran número de inyecciones con agujas de 0,254 mm de diámetro es una desventaja.

Aquí proporcionamos un enfoque alternativo para la entrega de ADN in vivo. El "acufection" </strong> protocolo describimos aquí proporciona una manera económica y eficiente para entregar ADN plasmídico en la piel del ratón. Brevemente, diez agujas de acupuntura (0,2 mm de diámetro x 13 mm de longitud) fueron atados en un manojo por cinta adhesiva. Un volumen de 10! L de PBS con 10 g de ADN plásmido que contiene el transgén de interés se colocó en el afeitado, depilación piel flanco crema-tratada. Mediante el uso del haz de aguja de acupuntura para oscilar la superficie (1 cm x 1 cm) de la piel, las queratinas en la capa córnea se aflojaron y el ADN plásmido aplicado a la superficie fue absorbida en la epidermis. daño de la piel se controló y se encontró que ser mínimo. La expresión del gen transfectado en la piel acufected fue confirmada por tanto cuantitativa en tiempo real PCR (qRT-PCR) y ELISA. Los efectos moduladores inmunes de acufection-entregado IL-15ΔE7 sobre la inflamación cutánea se demostraron usando el modelo de ratón IMQ tratados con 12. Mientras acufection demuestra ser una dema fácil y menosmétodo Nding para la entrega de ADN in vivo, la cantidad óptima de ADN de diferentes genes y los tiempos para pinchar la piel tiene que ser optimizado cuidadosamente para obtener resultados reproducibles.

Protocol

Los ratones hembra de 8 – 12 semanas de edad se utilizaron para este estudio. C57 / BL6 de tipo salvaje (WT) y la IL-15 deficientes (IL15 – / -) ratones fueron adquiridos de Laboratorio Nacional Centro de Animales (NLAC), Taiwán y Taconic Farm, respectivamente. IL-15-deficiente (IL15 – / -) y IL-15-dominante (IL15 e IL15 +/- + / +) mostró una proporción de 1: 3 en la segunda generación de la cruz de heterocigotos IL15 +/-. El genotipo de I…

Representative Results

Mientras que algunos enrojecimiento era evidente dentro de la primera hora después de pincharse con las agujas de acupuntura, la piel se aclaró en el día 2 y se observó ninguna reacción adversa de la piel hasta el día 7 después de pinchar (Figura 2A). Pinchazo de aguja indujo muy bajo nivel de ortoqueratosis epidérmica y dérmica mínima infiltración por H & E análisis en comparación con la piel no tratada (Figura 2B).</st…

Discussion

El paso más crítico para asegurar la expresión del ADN plásmido acufected es a oscilar y aflojar la capa córnea de la piel de manera uniforme. Mientras empuja las agujas suavemente sin cortar la piel, la fuerza debe ser lo suficientemente duro para deprimir la superficie. Para facilitar la absorción de ADN en 10 solución! L en un 1 cm x 1 cm área de la superficie, las agujas deben oscilar hacia arriba y hacia abajo por cerca de 100 veces en 30 s. Se puede determinar la fuerza que necesita para pinchar la piel y …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la subvención del Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST 103-2633-B-002-002; 104-2320-B-002-048). Agradecemos a los Dres. Betty Wu-Hsieh y Chien-Kuo Lee en NTU, Leigh Zerboni la Universidad de Stanford y el Dr. Peter Hoffmann en la Universidad de Hawai por leer el manuscrito, Yun Chien en la NTU para la asistencia técnica, y el Dr. Wen-Chi Wei en Agricultura Biotecnología Centro de Investigación de la Academia Sinica de asesoramiento técnico.

Materials

Accu Handy Needle Accu 36Gx0.5 Medical device
NairTM Lotion Church & Dwight N/A Use to remove hair
Shandon Xyline substitute Thermo Fisher Scientific 6764506 Deparaffinization
Avertin (2,2,2-Tribromethanol) Sigma-Aldrich T4,840-2 Anesthesia
2-methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463 Solvent for the dissolution of avertin
DifcoTM LB broth, Miller BD 244620 Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology
QIAGEN Plasmid Midi Kit QIAGEN 12143 Purification of plasmid DNA from E. coli
Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit eBioscience 88-7215 Measure IL-15 protein
Anti-mouse Ly6G BioLegend 127601 Antibody used for immunohistochemical stain
anti-mouse Ki-67 eBioscience 14-5698-80 Antibody used for immunohistochemical stain
Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) Nichirei Biosciences 414341F Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain
DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit Vector Laboratories SK-4100 Peroxidse substrate for immunohistochemical stain
Ultra V block Thermo Fisher Scientific TA-060-UB Reduce nonspecific background staining
Methyl green Sigma-Aldrich M8884 Nuclear staining
Vecta MountTM Vector Laboratories M-5000 Permanently preserving histochemical stains
Protease inhibitor cocktail tablets Roche 04-693-116-001 Inhibit protease activity in cell lysate
Aldara cream 3M Parmaceuticals N/A 5% imiquimod cream
Bessman Tissue Pulverizer Spectrum Labs 189475 Use to pulverize skin tissue
ABI7900HT cycler Thermo Fisher Scientific N/A quantitative real-time PCR assay
Camcorder Panasonic HDC-SD60 Image documentation
Axio Scope.A1 ZEISS N/A Bright-field microscopy
ScanScopeXT Aperio N/A Whole-field image scanner
MetaMorphⓇ Research Imaging Molecular Devices N/A Quantitative analysis of skin thickness and immune-reactive cells

References

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Cite This Article
Lin, Y., Lee, T., Ku, C. Development of an Economical DNA Delivery System by “Acufection” and its Application to Skin Research. J. Vis. Exp. (122), e55206, doi:10.3791/55206 (2017).

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