הכנה תצפית של דגימות ביולוגיות העבה ידי סריקת הילוכים אלקטרונים טומוגרפיה
Summary
This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.
Abstract
This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.
Introduction
מאז ה -1970 המוקדמות, טומוגרפיה גישות במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (TEM) היה בשימוש נרחב על האפיון המבני של דגימות ביולוגיות 1, 2, 3. הערעור של טומוגרפיה אלקטרונים הילוכים היה שזה יכול לשמש כדי לחקור מגוון רחב של מבנים ביולוגיים בקנה מידה ננומטרי, מן הארכיטקטורה של תאים ואת ultrastructure של אברונים למבנה מתחמי וחלבונים macromolecular. אף על פי כן, טומוגרפיה אלקטרוני הילוכים לא יכולה לשמש כדי לחקור דגימות עבות מאוד (יותר מ -0.5 מיקרומטר). ואכן, דגימות עבות לייצר אלקטרונים מפוזרים מדי, שהניבו נמוך יחס אות לרעש תמונות (SNR). בנוסף, טומוגרפיה כרוך האוסף של תמונות של דגימות מוטות, עם העובי לכאורה של המדגם עולה, עם זווית ההטיה. למרות פיזור קשיח ניתן לסנןמתוך באמצעות מסנני אנרגיה, הכמות הקריטית של אלקטרונים דרושים תמונות SNR גבוהות הוא הגיעה בקושי TEM. לפיכך, דגימות ביולוגיות עבות נחקרו רק באמצעות חתך 4.
כמה דוגמאות לא יכול להיות פרוס: מסוימים עשויים להתדרדר במידה ולא נחתכים, ואחרים צריכים להיחקר בשלמותם על מנת להבין את המורכבות שלהם. גישה חלופית היא להשתמש TEM סריקה במצב 5, 6, 7, 8. סריקה מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים (STEM), המסלול האופטי של האלקטרונים שונה מזו TEM הקונבנציונלי. אלקטרונים העובר דרך המדגם ללא פיזור ניתן לאסוף על הציר האופטי עם גלאי שדה בהיר (BF) 9, ואילו אלה מפוזרים בצורה אלסטית ניתן לאסוף בזווית מסוימת המצייר האופטי עם גלאי כהה שדה (DF).היתרון השני של גזע הוא כי אלומת האלקטרונים הממוקדת נסרקה על פני השטח של המדגם, המאפשרת פיקסל אחר פיקסל האוסף של התמונות. למרות אלומת אלקטרונים מרחיב תוך שהם מעבירים דרך המדגם 10, ערכת איסוף המסוים הזה רגיש פחות אלקטרונים מפוזרים inelastically מ TEM קונבנציונאלי. יתר על כן, אין עדשה שלאחר הדגימה ב- STEM, ובכך הימנעות עיוותים כרומטיים שיכול להתרחש TEM. אורכו המצלמה יכול להיות מותאם כך גלאי BF בעיקר מזהה אלקטרוני unscattered. באמצעות גלאי DF ללמוד דגימות עבות אינו מומלץ בגלל פיזור מרובה, אשר מפיק תמונות מדויקות. במקום זאת, גלאי BF יכול לשמש 11. בעוד גזע יכול להפיק תמונות SNR גבוהות, יש לו עומק השדה נמוך יחסית בגלל התכנסות קרן גבוהה יחסית TEM, להקטין את כמות מידע מעמיק כי ניתן להשבה מתוך עבהדגימות. במקרה של מיקרוסקופי STEM תקן סטייה, שבו זווית ההתכנסות יכולה להיות גבוהה ככל 30 mrad, העומק של השדה יכול להיות נמוך מספיק כך שהמידע כי היא בפוקוס מקורו במישור מוקד של רק כמה ננומטרים . הגדרת קרן אלקטרונים במצב מקביל משפר את עומק השדה של אלומת אלקטרונים על חשבון הרזולוציה 12. עם זאת, התקנה זו אינה תמיד אפשרית.
בכל פעם יש צורך להשתמש אלומת אלקטרונים התכנס, יש להשתמש בטכניקות אשר משפרות את עומק השדה של אלומת האלקטרונים כאשר לומדים דגימות עבות. מחקרים שנעשה לאחרונה דיווחו על רכישת מספר תמונות בבת מטוסים שונים מוקדי ברחבי המדגם לשחזר את הסכום המקסימאלי של מידע פוקוס 13, 14. שני המחקרים מתארים דרכים שונות לטפל במידע מן המטוסים מוקד שונים. Hovden et al.בשילוב בחלל פורה התמונות שנגבו לעבר מטוסים שונים מוקדים, ואת השיקום הסופי הושג ישירות ההופכי 3D התמר 13. לעומת זאת, Dahmen et al. פתח מנוע שחזור הקרן מתכנס לשחזר בחלל אמיתי נפח 3D מן המטוסים השונים מוקדי 14. המעבדה שלנו גם פתחה שיטת הדמית דגימות ביולוגיות עבות. האסטרטגיה שלנו הייתה שונה משתי השיטות שתוארו לעיל בכך שאנו התמזגנו המידע הוא בפוקוס המטוסים השונים מוקדי ושחזרנו את נפח 3D הסופי בחלל אמיתי באמצעות מקרן קרן מקביל 15. המטרה שלנו היתה לפתח שיטה שיכולה להתבצע בקלות בכל מעבדה במיקרוסקופ אלקטרונים. לשם כך, אנו מכוונים כדי לאסוף את התמונות מוקד כמות מוגבלת של זמן, להשוות את מסגרת הזמן של ניסויים טומוגרפיה קונבנציונליים. בנוסף, ג השיטה המוצעת שלנוולד להיות מותאם לשימוש עם סוגים שונים של יישור ותוכנות שחזור.
בהקשר של הפרסום שלנו משנת 2015 15, רצינו לדמיין ולאפיין את ההתאוששות של עומק השדה, כך השתמשנו זווית למחצה התכנסות גדולה של 25 mrad. כאן, אנו מציגים צעד-אחר-צעד פרוטוקול לביצוע באמצעות מוקד ההדמיה ב- STEM פי השיטה שפותחה במעבדה שלנו בשנת 2015 15, ואנחנו מציגים כיצד הנתונים משנת 2015 היה מעובד. שיטה זו משחזרת מידע פוקוס ממטוסים כמה מוקדי ברחבי דגימה ביולוגית עבה (750 ננומטר) ומאפשרת שחזורי 3D באיכות גבוהה. במידת הצורך, את ההבדלים מתודולוגיה זו לעומת השיטות שנוקטים קבוצות אחרות גם מוצגים.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול הכנת מדגם קונבנציונלי יחד עם מדריך צעד-אחר-צעד לביצוע ניתוח 3D על דגימות ביולוגיות עבות באמצעות STEM באמצעות מוקד טומוגרפיה. הטבעת שרף של דגימות ביולוגיות שמשה במשך עשרות שנתי 26, ופרוטוקולים חלופיים מותאמים מיני מדגמים שונים נ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by two ANR grants (ANR-11-BSV8-016 and ANR-10-IDEX-0001-02). We also acknowledge the PICT-IBiSA for providing access to chemical imaging equipment.
Materials
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 2860 | |
| Epoxy resin | EMS | 14120 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 °C. Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible. |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Osmium Tetroxyde | EMS | 19150 | |
| Uranyl Acetate | Sigma-Aldrich | 73943 | |
| Gelatin Capsule | EMS | 70110 | |
| Triming and Histo knives | LFG Distribution | Diatome diamond knives | |
| Electron Microscopy copper grid | LFG Distribution | G200-Cu | |
| Grid Coating Pen | LFG Distribution | 70624 | |
| Specimen Holder | JEOL | EM-21311 HTR | |
| Electron Microscope | JEOL | JEM-2200FS |
References
- De Rosier, D. J., Klug, A. Reconstruction of three dimensional structures from electron micrographs. Nature. 217 (5124), 130-134 (1968).
- Gan, L., Jensen, G. J. Electron tomography of cells. Q Rev Biophys. 45 (1), 27-56 (2012).
- Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. J Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).
- Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23 (18), 3583-3588 (2004).
- Koguchi, M., et al. Three-dimensional STEM for observing nanostructures. J Electron Microsc (Tokyo). 50 (3), 235-241 (2001).
- Midgley, P. A., Weyland, M. 3D electron microscopy in the physical sciences: the development of Z-contrast and EFTEM tomography. Ultramicroscopy. 96 (3-4), 413-431 (2003).
- Sousa, A. A., Azari, A. A., Zhang, G., Leapman, R. D. Dual-axis electron tomography of biological specimens: Extending the limits of specimen thickness with bright-field STEM imaging. J Struct Biol. 174 (1), 107-114 (2011).
- Sousa, A. A., Leapman, R. D. Development and application of STEM for the biological sciences. Ultramicroscopy. , 38-49 (2012).
- Ercius, P., Muller, D. Incoherent bright field STEM for imaging and tomography of ultra-thick TEM cross-sections. Microsc Microanal. 15, (2009).
- Hyun, J. K., Ercius, P., Muller, D. A. Beam spreading and spatial resolution in thick organic specimens. Ultramicroscopy. 109 (1), 1-7 (2008).
- Aoyama, K., Takagi, T., Hirase, A., Miyazawa, A. STEM tomography for thick biological specimens. Ultramicroscopy. 109 (1), 70-80 (2008).
- Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. Optimization of STEM tomography acquisition–a comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography. Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).
- Hovden, R., et al. Breaking the Crowther limit: combining depth-sectioning and tilt tomography for high-resolution, wide-field 3D reconstructions. Ultramicroscopy. 140, 26-31 (2014).
- Dahmen, T., et al. Combined scanning transmission electron microscopy tilt- and focal series. Microsc Microanal. 20 (2), 548-560 (2014).
- Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens. Micron. 77, 9-15 (2015).
- Weyland, M., Muller, D. A. Tuning the convergence angle for optimum STEM performance. FEI Nanosolutions. 1 (24), (2005).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
- Forster, B., Van De Ville, D., Berent, J., Sage, D., Unser, M. Complex wavelets for extended depth-of-field: a new method for the fusion of multichannel microscopy images. Microsc Res Tech. 65 (1-2), 33-42 (2004).
- Messaoudii, C., Boudier, T., Sanchez Sorzano, ., O, C., Marco, S. TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy. BMC Bioinformatics. 8, 288 (2007).
- Sorzano, C. O., et al. Marker-free image registration of electron tomography tilt-series. BMC Bioinformatics. 10, 124 (2009).
- Kohl, L., Bastin, P. The flagellum of trypanosomes. Int Rev Cytol. 244, 227-285 (2005).
- Luft, J. H. Improvements in epoxy resin embedding methods. J Biophys Biochem Cytol. 9, 409-414 (1961).
- Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for Transmission Electron Microscopy: preparation of biological samples. Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).
- Hovden, R., Xin, H. L., Muller, D. A. Extended depth of field for high-resolution scanning transmission electron microscopy. Microsc Microanal. 17 (1), 75-80 (2011).
- Dahmen, T., et al. The Ettention software package. Ultramicroscopy. 161, 110-118 (2016).
- Murata, K., et al. Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography. Ultramicroscopy. 146, 39-45 (2014).
- Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).
- Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
- Levin, B. D., et al. Nanomaterial datasets to advance tomography in scanning transmission electron microscopy. Sci Data. 3, 160041 (2016).
