Preparazione e di osservazione di campioni biologici spessi da Scanning Transmission Electron Tomografia

Summary

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Abstract

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

Introduction

Dall'inizio degli anni 1970, tomografia avvicina in microscopia elettronica a trasmissione (TEM) sono stati ampiamente utilizzati per la caratterizzazione strutturale di campioni biologici ^{1, 2, 3.} Il ricorso della tomografia elettronica a trasmissione era che potrebbe essere utilizzata per studiare una vasta gamma di strutture biologiche su scala nanometrica, dall'architettura delle cellule e l'ultrastruttura di organelli alla struttura di complessi macromolecolari e proteine. Tuttavia, tomografia elettronica a trasmissione non può essere usato per studiare campioni molto spessi (superiore a 0,5 micron). In effetti, i campioni di spessore producono troppi elettroni sparsi, generando basso rapporto segnale-rumore (SNR) immagini. Inoltre, tomografia comporta la raccolta di immagini di campioni inclinati, con lo spessore apparente del campione aumenta con l'angolo di inclinazione. Anche se scattering anelastico può essere filtratautilizzando filtri di energia, la quantità critica di elettroni necessari per le immagini ad alta SNR è a malapena raggiunto in TEM. Quindi, campioni biologici di spessore sono stati studiati solo mediante sezionamento ^4.

Alcuni campioni non possono essere tagliati: alcuni potrebbero deteriorarsi se non vengono tagliati, e gli altri devono essere studiati nella loro interezza al fine di comprendere la loro complessità. Un approccio alternativo consiste nell'utilizzare TEM in modalità ^{5, 6, 7, 8} scansione. In scansione microscopia elettronica a trasmissione (STEM), il percorso ottico degli elettroni è diversa da quella in TEM convenzionale. Gli elettroni che passano attraverso il campione senza dispersione possono essere raccolti sull'asse ottico con un rivelatore ⁹ campo chiaro (BF), mentre quelli sparsi elasticamente possono essere raccolti in un certo angolo rispetto all'asse ottico con un rivelatore di campo scuro (DF).L'altro vantaggio di STEM è che il fascio elettronico focalizzato viene scansionato alla superficie del campione, consentendo la raccolta di pixel-per-pixel delle immagini. Anche se il fascio elettronico allarga mentre passa attraverso il campione ^10, questo particolare sistema di raccolta è meno sensibile agli elettroni anelasticamente sparsi rispetto TEM convenzionale. Inoltre, non vi è nessun obiettivo post-campione in STEM, evitando le aberrazioni cromatiche che possono verificarsi in TEM. La lunghezza telecamera può essere regolata in modo che il rilevatore BF rileva principalmente elettroni unscattered. Utilizzando il rilevatore di DF per studiare campioni di spessore non è raccomandato a causa di scattering multiplo, che produce immagini imprecise. Invece, il rivelatore BF può essere utilizzato ^11. Mentre staminali possono produrre alti immagini SNR, ha una relativamente bassa profondità di campo per la convergenza relativamente elevato fascio rispetto al TEM, diminuendo la quantità di informazioni approfondite che possono essere recuperate da spessaesemplari. Nel caso di microscopi STAMINALI aberrazione-corretto, in cui l'angolo di convergenza può essere alto come 30 mrad, la profondità di campo-può essere sufficientemente bassa in modo che le informazioni che è a fuoco proviene da un piano focale di solo pochi nanometri . Impostazione del fascio di elettroni in modo parallelo aumenta la profondità di campo del fascio di elettroni a scapito della risoluzione ^12. Tuttavia, questa configurazione non è sempre possibile.

Qualora sia necessario utilizzare un fascio convergente di elettroni, si dovranno impiegare tecniche che esaltano la profondità di campo del fascio elettronico studiando campioni spessi. Recenti studi hanno riportato l'acquisizione di immagini multiple in diversi piani focali per tutto il campione di recuperare la massima quantità di informazioni di messa a fuoco ^{13, 14.} I due studi descrivono modi diversi per gestire le informazioni dai diversi piani focali. Hovden et al.combinati nello spazio di Fourier le immagini che sono stati raccolti in diversi piani focali, e la ricostruzione finale è stato ottenuto direttamente dalla inversa 3D trasformata di Fourier ^13. Al contrario, Dahmen et al. sviluppato un motore ricostruzione fascio convergente ricostruire nello spazio reale volume 3D dai vari piani focali ^14. Il nostro laboratorio ha anche sviluppato un metodo per l'imaging campioni biologici spessi. La nostra strategia era diverso dai due metodi descritti in precedenza in quanto ci siamo fusi l'informazione che è a fuoco nei vari piani focali e ricostruito il volume 3D finale nello spazio reale utilizzando un proiettore fascio parallelo ^15. Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un metodo che può essere facilmente eseguito in qualsiasi laboratorio di microscopia elettronica. A questo scopo, abbiamo voluto raccogliere le immagini focali in una quantità limitata di tempo, paragonabile al lasso di tempo di esperimenti tomografia convenzionali. Inoltre, il metodo proposto could essere adattato per l'uso con differenti tipi di allineamento e software di ricostruzione.

Nel contesto della nostra pubblicazione dal 2015 ^15, volevamo visualizzare e caratterizzare il recupero della profondità di campo, quindi abbiamo usato una grande convergenza semi-angolo di 25 mrad. Qui, vi presentiamo un protocollo step-by-step per l'esecuzione tramite-focale di imaging in STEM secondo il metodo messo a punto nel nostro laboratorio nel 2015 ^15, e presentiamo come i dati a partire dal 2015 è stato elaborato. Questo metodo recupera informazioni a fuoco da diversi piani focali tutta una (750 nm) campione biologico spessore e permette ricostruzioni 3D di alta qualità. Se del caso, vengono anche presentate le differenze in questa metodologia rispetto i metodi utilizzati da altri gruppi.

Protocol

Attenzione: consultare le schede di sicurezza dei materiali (MSDS) dei vari reagenti prima di utilizzarli. Molti dei prodotti chimici utilizzati durante la preparazione dei campioni sono tossiche, cancerogene, mutagene e / o tossiche per la riproduzione. Utilizzare dispositivi di protezione individuale (guanti, camice, pantaloni full-length, e scarpe chiuse) e il lavoro sotto una cappa aspirante durante la manipolazione del campione. Sezionamento il campione con un ultramicrotomo prevede l'utilizzo di strumenti appu…

Representative Results

Nel nostro studio, gli elettroni sono stati accelerati a 200 kV nel microscopio elettronico a trasmissione pistola emissione di campo. Le immagini sono state raccolte in modalità STEM BF utilizzando un tempo di sosta di 20 ms. Per quanto riguarda il disegno del tilt-serie passante focale, abbiamo riscontrato che gli intervalli di messa a fuoco di 150 nm hanno dato risultati soddisfacenti per lo studio ultrastrutturale di un campione, anche se la profondità di campo-del fascio di elettr…

Discussion

In questo articolo, vi presentiamo un protocollo convenzionale preparazione del campione insieme a una guida passo-passo per l'esecuzione di analisi 3D su campioni biologici spessi usando STEM attraverso focale tomografia. Resina incasso di campioni biologici è stato utilizzato per decenni ²⁶ e protocolli alternativi che si adattano a diversi tipi di campioni si trovano in tutta la letteratura ^27. Al contrario, di imaging campioni spessi in staminali utilizzando metod…

Materials

Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	P4417
Ethanol	Sigma-Aldrich	2860
Epoxy resin	EMS	14120
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 °C. Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible.
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Osmium Tetroxyde	EMS	19150
Uranyl Acetate	Sigma-Aldrich	73943
Gelatin Capsule	EMS	70110
Triming and Histo knives	LFG Distribution	Diatome diamond knives
Electron Microscopy copper grid	LFG Distribution	G200-Cu
Grid Coating Pen	LFG Distribution	70624
Specimen Holder	JEOL	EM-21311 HTR
Electron Microscope	JEOL	JEM-2200FS