Utarbeidelse og Observasjon av Thick biologiske prøver av Scanning Transmission Electron Tomography

Summary

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Abstract

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

Introduction

Siden tidlig på 1970-tallet, nærmer tomografi i transmisjonselektronmikroskopi (TEM) har vært mye brukt for den strukturelle karakterisering av biologiske prøver ^{1, 2, 3.} Anken av transmisjonselektron tomography var at det kunne brukes til å undersøke et bredt spekter av biologiske strukturer i nanometerskala, fra arkitekturen av celler og organeller av ultra til strukturen av makromolekylære komplekser og proteiner. Likevel transmisjonselektron tomografi kunne ikke brukes til å studere meget tykke prøver (større enn 0,5 um). Faktisk, tykke prøver produserer for mange spredte elektroner, genererer lavt signal-til-støy-forhold (SNR) bilder. I tillegg innebærer tomografi innsamling av bilder av skråstilte prøver, med den tilsynelatende tykkelse av prøven øker med hellingsvinkelen. Selv om inelastisk spredning kan filtreresut ved hjelp av energi filtre, er den kritiske mengden av elektroner som trengs for høy SNR bilder knapt oppnådd i TEM. Derfor har tykke biologiske prøver bare studert ved hjelp av seksjonering ^4.

Noen prøver kan ikke være skiver: noen kan brytes ned når de er kuttet, og andre trenger å bli studert i sin helhet for å forstå sin kompleksitet. En alternativ tilnærming er å bruke TEM i skannemodus ^{5, 6, 7, 8.} I skanning transmisjonselektronmikroskopi (STEM), er den optiske banen for elektronene er forskjellig fra den i konvensjonell TEM. Elektroner som passerer gjennom prøven uten spredning kan bli samlet på den optiske akse med en lys-felt (BF) detektor ^9, mens de spredt elastisk kan samles opp i en bestemt vinkel fra den optiske akse med en mørkfelt (DF) detektor.Den andre fordelen med STEM er at den fokuserte elektronstrålen blir avsøkt ved overflaten av prøven, slik at piksel-for-piksel samling av bildene. Selv om elektronstråle utvider mens passerer gjennom prøven ^10, er dette spesielt innsamlingsordning mindre følsom for uelastisk spredte elektronene enn konvensjonell TEM. Videre er det ingen objektiv post-prøven i STEM, og dermed unngå de kromatiske avvik som kan oppstå i TEM. Kameraet lengde kan justeres slik at den BF detektoren detekterer hovedsakelig unscattered elektroner. Ved hjelp av DF-detektor for å studere tykke prøver er ikke anbefalt på grunn av multippel-spredning, som produserer unøyaktige bilder. I stedet kan det BF detektoren brukes ^11. Mens STEM kan produsere høy SNR-bilder, den har en relativt lav dybde-of-field på grunn av den relativt høye strålen konvergens i forhold til TEM, redusere mengden av detaljert informasjon som kan utvinnes fra tykkprøver. I tilfelle av aberrasjon-korrigerte STEM mikroskoper, hvor konvergensvinkelen kan være så høyt som 30 mrad, kan den dybdeskarpheten være lav nok slik at den informasjon som er i fokus stammer fra et fokalplan på bare noen få nanometer . Sette opp elektronstråle i parallell modus øker dybdeskarpheten av elektronstråle til skade for resolusjonen ^12. Men dette oppsettet ikke alltid mulig.

Når det er nødvendig å anvende en konvergerende elektronstråle, må man bruke teknikker som forbedrer dybdeskarpheten av elektronstrålen når man vil studere tykke prøver. Nyere studier har rapportert kjøp av flere bilder på ulike knutepunkter fly hele prøven for å gjenopprette den maksimale mengden av fokusinformasjon ^{13, 14.} De to studier beskriver ulike måter å håndtere informasjon fra de ulike fokalplanene. Hovden et al.kombinert i Fourier plass bildene som ble samlet inn på ulike fokusplan, og den endelige gjenoppbyggingen ble hentet direkte fra 3D inverse Fourier transform ^13. I motsetning til dette, Dahmen et al. utviklet en konvergent stråle rekonstruksjon motor å rekonstruere i reell plass 3D-volumet fra de ulike fokusplan ^14. Vårt laboratorium også utviklet en metode for å avbilde tykke biologiske prøver. Vår strategi var forskjellig fra de to metodene som er beskrevet ovenfor ved at vi fusjonerte opplysningene som er i fokus i de forskjellige fokale plan og rekonstruert den endelige 3D volumet i fast plass ved hjelp av en parallell stråle projektor ^15. Vårt mål var å utvikle en metode som lett kan utføres i en hvilken som helst elektronmikroskopi laboratorium. For dette formål tar sikte vi å samle fokal bildene i en begrenset tid, kan sammenlignes med den tidsramme på konvensjonell tomografi eksperimenter. I tillegg har vi foreslått metode could tilpasses for bruk med forskjellige typer innretting og gjenoppbygging programvare.

I sammenheng med vår publikasjon fra 2015 ^15, ønsket vi å visualisere og karakterisere utvinning av dybdeskarpheten, så vi brukte en stor konvergens semi-vinkel på 25 mrad. Her presenterer vi en trinn-for-trinn-protokoll for å utføre gjennomgående midt bildebehandling i STEM i henhold til den metode som er utviklet i vårt laboratorium i 2015 ^15, og presenterer vi hvordan dataene fra 2015 ble behandlet. Denne metoden gjenfokus informasjon fra flere fokusplan gjennom en tykk (750 nm) biologisk prøve og muliggjør høykvalitets 3D rekonstruksjoner. Der det er relevant, er forskjellene i denne metodikken versus de metoder som brukes av andre grupper også presentert.

Protocol

Forsiktig: Se i sikkerhetsdatablad (MSDS) for de forskjellige reagenser før du bruker dem. Flere av kjemikaliene som brukes under tillagingen er giftige, kreftfremkallende, arvestoffskadelige og / eller reprotoksiske. Bruk personlig verneutstyr (hansker, frakk, full-lengde bukser og lukket-toe sko) og arbeid under en avtrekkshette ved håndtering av prøven. Seksjonering av prøven med en ultramicrotome innebærer bruk av skarpe instrumenter, og forsiktig bruk av disse verktøyene er obligatorisk. I trinnene som er bes…

Representative Results

I vår studie ble elektroner akselereres til 200 kV i feltavgi pistolen transmisjonselektronmikroskop. Bilder ble samlet inn i STEM BF-modus ved hjelp av en 20-us holdetid. Når det gjelder utformingen av gjennomgående fokus tilt-serien, fant vi at fokus intervaller på 150 nm ga tilfredsstillende resultater for ultra studie av en 750 nm tykk biologisk prøve-selv om dybdeskarpheten av elektronstråle var bare 3 nm-siden vi brukte en meget stor konvergens halvvinkel på 25 Mrad. <p …

Discussion

I denne artikkelen presenterer vi en konvensjonell prøveopparbeidelse protokollen sammen med en steg-for-steg guide for å utføre 3D analyser på tykke biologiske prøver ved hjelp STEM gjennomgående fokus tomografi. Resin innebygging av biologiske prøver har vært brukt i flere tiår ²⁶ og alternative protokoller som er tilpasset ulike typer prøver kan bli funnet i hele litteratur ^27. I kontrast, bilde tykke belegg i STEM hjelp gjennom fokusmetoder er en ny oppgave, …

Materials

Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	P4417
Ethanol	Sigma-Aldrich	2860
Epoxy resin	EMS	14120
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 °C. Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible.
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Osmium Tetroxyde	EMS	19150
Uranyl Acetate	Sigma-Aldrich	73943
Gelatin Capsule	EMS	70110
Triming and Histo knives	LFG Distribution	Diatome diamond knives
Electron Microscopy copper grid	LFG Distribution	G200-Cu
Grid Coating Pen	LFG Distribution	70624
Specimen Holder	JEOL	EM-21311 HTR
Electron Microscope	JEOL	JEM-2200FS