En Aptamer basert sensor for uchelatert gadolinium (III)

Summary

The use of polydeoxynucleotide (44-mer aptamer) molecules for sensing unchelated gadolinium(III) ion in an aqueous solution is described. The presence of the ion is detected via an increase in the fluorescence emission of the sensor.

Abstract

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd³⁺) in aqueous solution is demonstrated. Gd³⁺ is often present in samples of gadolinium-based contrast agents as a result of incomplete reactions between the ligand and the ion, or as a dissociation product. Since the ion is toxic, its detection is of critical importance. Herein, the design and usage of an aptamer-based sensor (Gd-sensor) for Gd³⁺ are described. The sensor produces a fluorescence change in response to increasing concentrations of the ion, and has a limit of detection in the nanomolar range (~100 nM with a signal-to-noise ratio of 3). The assay may be run in an aqueous buffer at ambient pH (~7 – 7.4) in a 384-well microplate. The sensor is relatively unreactive toward other physiologically relevant metal ions such as sodium, potassium, and calcium ions, although it is not specific for Gd³⁺ over other trivalent lanthanides such as europium(III) and terbium(III). Nevertheless, the lanthanides are not commonly found in contrast agents or the biological systems, and the sensor may therefore be used to selectively determine unchelated Gd³⁺ in aqueous conditions.

Introduction

Den økende betydning av magnetisk resonansavbildning (MRI) i klinisk diagnose, som er begrenset av den iboende følsomheten av teknikken, har resultert i den raske veksten av forskning på utvikling av nye gadolinium-baserte kontrastmidler (GBCAs) ^1. GBCAs er molekyler som administreres for å forbedre bildekvaliteten, og de vanligvis har den kjemiske strukturen av et treverdig ion gadolinium (Gd ³⁺⁾ koordinert til en polydentat ligand. Dette kompleks er av avgjørende betydning som uchelatert Gd ³⁺ er giftig; det har vært innblandet i utviklingen av nefrogen systemisk fibrose hos noen pasienter med nyresykdom eller fiasko ^2. Følgelig, oppdager den vandige fri ion er instrumental i å sikre sikkerheten til GBCAs. Tilstedeværelsen av uchelatert Gd ³⁺ i gbca løsninger ofte er resultatet av en ufullstendig reaksjon mellom liganden og den ion, dissosiasjon av komplekset, eller fortrengningt av andre biologiske metallkationer ^3.

Blant de mange teknikker som for tiden anvendes for å bestemme tilstedeværelsen av Gd ^3+, de som er avhengig av kromatografi og / eller spektrometri rang høyest når det gjelder fleksibilitet og anvendbarhet ^4. Blant deres styrke er høy følsomhet og nøyaktighet, evnen til å analysere ulike eksempel matriser (inkludert humant serum ^5, urin og hår ^{6, 7} avløpsvann, og kontrastmiddel formuleringer ^8), og den samtidige kvantifisering av flere Gd ^{3 +} komplekser (en liste studier før 2013 er beskrevet i en omfattende gjennomgang av Telgmann et al.) ^4. Den eneste ulempen er at flere av disse metodene krever besetninger (som induktivt koplet plasma-massespektrometri) ⁴ at noen laboratorier kanskje ikke har tilgang til. Innenfor rammen av romanen gbca funn i forskning og proof-of-concept nivåer, arelatively mer praktisk, rask og kostnadseffektiv spektroskopisk basert metode (for eksempel UV-Vis absorpsjon eller fluorescens) kan tjene som et verdifullt alternativ. Med disse programmene i tankene, var en fluorescerende aptamer basert sensor for vann Gd ³⁺ utviklet ^ni.

Den aptamer (Gd-aptamer) er et 44-base-lang enkelt-trådet DNA-molekyl med en spesifikk sekvens av baser som ble isolert gjennom prosessen med systematiske utskilling av ligander med eksponensiell anrikning (SELEX) ^9. For å tilpasse den aptamer til en fluoriserende sensor, er en fluorofor festet til 5'-terminale ende av tråden, som deretter hybridisert med en slukke tråd (QS) via 13 komplementære baser (figur 1). QS er merket med en mørk quencher molekyl ved 3'-terminus. I fravær av Gd ^3+, føleren (Gd-sensor), som består av en 1: 2 molforhold av Gd-aptamer og QS henholdsvis, vil ha minimal fluorescens-emisjon på grunn av to energioverføring fra fluoroforen til drikk. Tilsetningen av vandig Gd ³⁺ vil fortrenge QS fra Gd-aptamer, noe som resulterer i en økning i fluorescensemisjon.

Figur 1. Sensor (Gd-sensor) som består av 44-base-lang aptamer (Gd-aptamer) merket med fluorescein (en fluorofor) og 13-base-quenching lang tråd (QS) merket med dabcyl (en mørk quencher) . I fravær av uchelatert Gd ^3+, fluorescensen av sensoren er minimal. Under tilsetning av Gd ^3+, forskyvning av QS inntreffer og en økning i fluorescensemisjon observeres. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Det finnes i dag, en vanlig brukt spektroskopisk basert metode for å detektereing vandig Gd ^3+. Denne analysen anvender molekylet xylenolorange, som gjennomgår en forskyvning i den maksimale absorpsjon bølgelengde 433-573 nm ved chelatering å ionet ^10. Forholdet mellom disse to absorbans maksima kan brukes til å kvantifisere mengden av uchelatert Gd ^3+. Den aptamer sensoren er et alternativ (kan også være komplementær) til den xylenolorange assay, som de to metodene har forskjellige reaksjonsbetingelser (for eksempel pH og sammensetningen av de bufferoppløsninger som brukes), mål-selektiviteter, lineære områder av kvantifisering, og deteksjons modaliteter ^9.

Protocol

MERK: Molecular biology grade vann brukes i alle buffer og løsningsmidler. Alle disponibel rør (mikrosentrifugerør og PCR) og pipettespisser er DNase- og RNase-fritt. Vennligst se dataarket for materialsikkerhet (MSDS) for alle kjemikalier før bruk. Bruk av egnet personlig verneutstyr (PVU) anbefales sterkt. 1. Utarbeidelse av Aptamer Stock Solutions Kjøp 2 tråder polydeoxynucleotide kommersielt. Bestille begge tråder med rensing ved hjelp av væskekromatografi med høy yte…

Representative Results

En typisk fluorescens forandring av Gd-sensoren oppløsning i nærvær av uchelatert Gd 3+ er vist i figur 2. Utslippet kan bli plottet som fluorescensen ganger endring (figur 2A) eller den rå fluorescens-leser (figur 2B) i vilkårlige enheter (AFU). Begge plottene, hvilket ga svært lignende kalibreringskurver med et lineært område for konsentrasjoner av Gd 3+ under 1 um og metning av signalet ved> 3 uM. Påv…

Discussion

Ved hjelp av aptamer-baserte Gd-sensor, en økning i fluorescensemisjon som er proporsjonal med konsentrasjonen av uchelatert Gd ³⁺ observeres. Å minimalisere mengden av prøve som brukes, kan analysen bli kjørt i en 384-brønners mikroplate med et totalt prøvevolum på 45 ul pr brønn. I denne designen, ble valget av fluorescein (FAM) og dabcyl (DAB) i hovedsak basert på kostnaden av reagenser; for å modifisere emisjonsbølgelengden, en annen sammenkobling av fluorofor og slukkeren kan brukes ^11.</…

Materials

Gd-aptamer	IDTDNA	Input sequence and fluorophore modification in the order form	A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
Quenching strand	IDTDNA	Input sequence and quencher modification in the order form	A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
Molecular biology grade water			No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well
Gadolinium(III) chloride anhydrous	Strem	936416	Toxic
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Magnesium chloride anhydrous	MP Biomedicals	0520984480 – 100 g
Sodium Chloride	Acros Organics	327300025
Potassium chloride	Fisher Scientific	P333-500
Sodium hydroxide, pellets	Fisher Scientific	BP359	Corrosive
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	SA49	Toxic and corrosive
384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates	Corning	3575	Plates which are suitable for fluorescence reading are required.
Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter	Thermo Scientific	5680020	The bottle top is fitted with  0.2 micron PES membrane
Disposable sterile bottles 250 mL	Corning	430281	A larger or smaller bottle may be used
1.5 mL microcentrifuge tubes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
0.2 mL PCR tubes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
Micropipets			No specific manufacturer
Pipet tips (non filter) of appropriate sizes			No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
Name of Equipment
Plate reader	Biotek Synergy H1		Plate readers from other manufacturers would work equally well