सह-immunoprecipitation द्वारा परमाणु और cytoplasmic भागों में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के दृश्य और<em> बगल में</em> निकटता Ligation परख
Summary
Protein-protein interactions can occur in both the nucleus and the cytoplasm of a cell. To investigate these interactions, traditional co-immunoprecipitation and modern proximity ligation assay are applied. In this study, we compare these two methods to visualize the distribution of NF90-RBM3 interactions in the nucleus and the cytoplasm.
Abstract
Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation is a popular technique to detect protein-protein interactions. Subsequent Western blot analysis is the most common method to visualize co-immunoprecipitated proteins. Recently, the proximity ligation assay has become a powerful tool to visualize protein-protein interactions in situ and provides the possibility to quantify protein-protein interactions by this method. Similar to conventional immunocytochemistry, the proximity ligation assay technique is also based on the accessibility of primary antibodies to the antigens, but in contrast, proximity ligation assay detects protein-protein interactions with a unique technique involving rolling-circle PCR, while conventional immunocytochemistry only shows co-localization of proteins.
Nuclear factor 90 (NF90) and RNA-binding motif protein 3 (RBM3) have been previously demonstrated as interacting partners. They are predominantly localized in the nucleus, but also migrate into the cytoplasm and regulate signaling pathways in the cytoplasmic compartment. Here, we compared NF90-RBM3 interaction in both the nucleus and the cytoplasm by co-immunoprecipitation and proximity ligation assay. In addition, we discussed the advantages and limitations of these two techniques in visualizing protein-protein interactions in respect to spatial distribution and the properties of protein-protein interactions.
Introduction
परमाणु कारक 90 (NF90) इंटरल्यूकिन -2 के बाद प्रतिलेखन और miRNA जीवजनन 1-3 के नियमन के वायरल संक्रमण के जवाब, विनियमन सहित कई कार्यों के साथ एक बहु-isoform प्रोटीन होता है। RBM3 एक शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन, अनुवाद और miRNA जीवजनन में शामिल हैं और हाइपोथर्मिया और हाइपोक्सिया 4-6 सहित विभिन्न तनाव से प्रेरित किया जा सकता है। हाल ही में, हम एक प्रोटीन जटिल 7 में NF90 और RBM3 पाया। NF90 और RBM3 की बातचीत सामने आया प्रोटीन प्रतिक्रिया 7 में प्रोटीन काइनेज शाही सेना की तरह जालिका काइनेज (पर्क) गतिविधि मिलाना अनिवार्य है। दोनों NF90 और RBM3 नाभिक लेकिन कोशिका द्रव्य में NF90 के एक छोटे से अनुपात और RBM3 शटल में मुख्य रूप से स्थित है और विशिष्ट कार्यों के लिए एक दूसरे के लिए वहाँ बाँध, जैसे पर्क गतिविधि को विनियमित करने के लिए कर रहे हैं। इसलिए, यह subcellular डिब्बे में NF90-RBM3 बातचीत का वितरण कल्पना करने के लिए है, जो संकेत हो सकता महत्वपूर्ण हैसंबंधित डिब्बे में उनके विभिन्न भूमिकाओं।
दशकों पहले, खमीर दो संकर (Y2H) दो प्रोटीन 8 के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए विकसित किया गया था। हालांकि, जुड़े प्रोटीन का कृत्रिम निर्माण की वजह से, झूठी सकारात्मक परिणाम इस विधि के आवेदन प्रतिबंधित कर दिया है। एक लंबे समय के लिए, सह immunoprecipitation, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का विश्लेषण करने के लिए विशेष रूप से endogeneous की स्थिति 9 में मुख्य तकनीक था। सह immunoprecipitated प्रोटीन जटिल विश्लेषण करने के लिए, पश्चिमी धब्बा जबकि मास स्पेक्ट्रोमेट्री जब सुपर संवेदनशीलता और सटीकता वांछित हैं प्रयोग किया जाता है, सबसे सुविधाजनक तकनीक है। हाल के वर्षों में, निकटता बंधाव परख सीटू 10,11 में दोनों कोशिकाओं और ऊतकों में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए एक उपन्यास विधि के रूप में विकसित किया गया है।
यहाँ, हम सबसे लोकप्रिय सह immunoprecipitation विधि और NF9 पर कब्जा करने में अपेक्षाकृत उपन्यास निकटता बंधाव परख विधि की तुलनाsubcellular भागों में 0-RBM3 बातचीत। हम यह भी फायदे और दोनों तकनीकों की सीमाओं पर चर्चा की।
Protocol
Representative Results
Discussion
वहाँ कई लाभ के साथ ही दोनों तरीकों के लिए कमियाँ हैं। एक अपेक्षाकृत उपन्यास तकनीक के रूप में, निकटता बंधाव परख की एक स्पष्ट लाभ व्यवहार्यता एकल कोशिका स्तर के बजाय विषम कोशिकाओं का एक बैच में प्रोटीन, प?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Swiss National Science Foundation (SNSF, 31003A_163305).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D6429 | High glucose 4500 mg/L |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin (PenStrep) | BioConcept | 4-01F00-H | |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth | 6908.3 | |
| Dynabeads Protein G | Novex, Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| DRBP76 (NF90/NF110) antibody | BD Transduction Laboratories | 612154 | use 1:1000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| RBM3 antibody | ProteinTech | 14363-1-AP | use 1:1000 for WB and 1:100 for ICC/PLA |
| Lamin A/C antibody | Cell Signaling Technology | #2032 | use 1:1000 for WB |
| anti-GAPDH antibody | Abcam | ab8245 | use 1:1000 for WB |
| normal rabbit IgG | Santa Cruz | sc-2027 | |
| anti-rabbit IgG, HRP-lined secodary antiboy | Cell Signaling Technology | #7074 | use 1:5000 for WB |
| anti-mouse HRP secondary antibody | Carl Roth | 4759.1 | use 1:5000 for WB |
| Clarity Western ECL Blotting Substrate | Bio-Rad | #1705060 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | CarlRoth | 6908.1 | |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0002 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP00061 | |
| Amersham Hypond P 0.2 PVDF membrane | GE Healthcare Life Sciences | 10600021 | |
| Super RX X-ray film | Fujifilm | 4741029230 | |
| Poly-D-Lysine 8 Well Culture Slide | Corning BioCoat | 354632 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Normal goat serum (NGS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| 4′, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Duolink PLA probe Anti-mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink PLA probe Anti-rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink Detection Reagents Red | Sigma | DUO92008 | |
| Duolink Wash Buffers Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Duolink Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
| Microscope | Olympus | AX-70 | |
| CCD camera | SPOT | Insight 2MP Firewire | |
| X-ray film | Fujifilm | Super RX | |
| Film processing machine | Fujifilm | FPM-100A |
References
- Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication?. Biochimie. 108, 20-24 (2015).
- Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization. Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).
- Sakamoto, S., et al. The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway. Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).
- Dresios, J., et al. Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis. Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).
- Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis. Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).
- Wellmann, S., et al. Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism. J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).
- Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress. FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
- Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein. J Vis Exp. (98), (2015).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).
- Jarvius, M., et al. In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method. Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).
- Liu, C. H., et al. Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma. Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).
