쥐의 눈으로 인간 망막 안료 상피 세포의 트랜스 scleral Subretinal 이식에 대 한 세련 된 프로토콜의 개발

Summary

Subretinal 주입은 나이 관련 황 반 변성에 대 한 줄기 세포 대체 요법의 전 임상 연구에 널리 적용 되었다. 이 시각화 된 문서에서는, 우리 쥐 눈 세포를 제공 하는 트랜스 scleral 접근을 통해 덜 위험 하 고, 재현 고 정확 하 게 수정 subretinal 주입 기술을 설명 합니다.

Abstract

연령 관련 황 반 변성 (AMD) 등 퇴행 성 망막 질환 전세계 돌이킬 수 없는 시력 상실의 주요 원인입니다. AMD는 기능적으로 지원 하 고 해부학 신경 망막 주위 세포의 단층 망막 안료 상피 (RPE) 세포의 변성에 의해 특징입니다. 비 신생 AMD (건식 AMD)에 대 한 현재 약물 치료는 질병의 진행을 느리게만 겨냥 한 새로운 치료 전략을 식별 하는 연구를 필요로 하는 비전을 복원할 수 없습니다. 건식 AMD를 미래에 치료 건강 한 세포 파악 약속 퇴행 성 RPE 세포를 교체. AMD에 대 한 줄기 세포 대체 요법의 광범위 한 전 임상 연구 참여 subretinal 사출 기술을 적용 동물 모델의 subretinal 공간으로 줄기 세포 유래 RPE 세포의 이식. 이러한 전 임상 동물 연구에서 가장 자주 사용 하는 접근 어려운 바늘 끝의 직접적인 시각화의 부족에 의해 만들어지고 종종 망막 손상 될 수 있습니다 트랜스 scleral 경로입니다. 유리 체를 통해 다른 접근 바늘 끝 위치의 직접 관찰에 대 한 수 있지만 더 많은 눈 조직 방해로 수술 외상의 높은 위험을 운반. 덜 위험 하 고 재현할 수 수정된 트랜스 scleral 주입 방법 정의 바늘 각도 깊이 사용 하 여 성공적으로 하 고 일관 되 게 쥐 subretinal 공간으로 RPE 세포를 제공 하 고 과도 한 망막 손상을 방지를 개발 했습니다. 이 방식으로 전달 하는 세포는 2 개월 이상에 대 한 외과 의사의 왕 대학 (RCS) 쥐에 효능 되도록 이전 입증 되었습니다. 이 기술은 세포 이식 뿐만 아니라 작은 분자 또는 유전자 요법의 배달을 위해 사용할 수 있습니다.

Introduction

인간의 망막 눈 기능 뒤 가벼운 감각 조직으로 있으며 비전 인식에 중요 한 역할을 한다. 망막 세포 역 기능 또는 세포 죽음 따라서 시력 문제 또는 영구적인 실명을 발생합니다. 변성 또는 망막의 다른 층에 있는 세포의 기능 장애와 관련 된 장애 퇴행 성 망막 질환, 중 AMD는 가장 일반적인 유형 및 선진국 ^{노인에 돌이킬 수 없는 실명의 주요 원인으로 알려져 있습니다. 1,2}. AMD의 병 적인 과정은 관련 RPE 레이어와 차례로 손상의 포토 리셉터 생리학, 신경 망막 위축 및 비전 손실^{3, RPE 지원 기본 Bruch 막 사이 “드루” 축적 된 4,5}. 지금까지, 치료법은 고급 건조 (비 신생) AMD. 재생 의학의 새로운 패러다임으로 줄기 세포 치료의 출현 줄기 세포 유래 건강 한 세포 기능 장애 또는 죽은 RPE 세포 교체의 희망을 제공 합니다. 실제로, 이식의 광범위 한 전 임상 연구 줄기 세포 (예를들면, 인간 배아 줄기 세포)-RPE 퇴행 성 동물 모델에 파생 된 RPE 세포 수행된^6,7, 일부는에 진행 되었습니다 임상 시험^8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). 최근, 줄기 세포 인간의 RPE 레이어, 인간의 RPE 줄기 세포 (hRPESCs)에서의 대안 소스 우리의 실험실에 의해 확인 되었다와 amd hRPESC 파생 된 RPE 세포 (hRPESC-RPE) 이식 치료의 임상 연구에서 현재 사용 되 고 ^{10 , 11 , 12 , 13}.

Subretinal 주입 기술은 우리의 그룹을 포함 하 여 여러 그룹에 의해 위에서 언급 한 전 임상 연구에 적용 됩니다. 동물에서 subretinal 주입을 위한 일반적인 방법은 두 가지: 트랜스 vitreal 및 트랜스 scleral. 트랜스-vitreal 접근 앞쪽 눈 침투, 십자가 전체 vitreal 구멍 렌즈에 인접 하 고 침투는 subretinal 도달 하 눈 뒤에 망막 바늘 끝을 직접 관찰할 수 있는 외과 의사의 이점이 있다 공간^14,,1516. 그러나, 그것은 렌즈, 손상의 위험 전달 하 고 바늘을 철회 하는 때 유리 체로 셀의 역류에서 발생할 수 있습니다 (앞쪽에 및 사후), 두 개의 위치에 망막을 방해를 요구 한다. 반면, 트랜스 sclera 접근의 원칙, 망막 및 유리 체의 관련을 방지 하 고 역류 눈을 종료 합니다. 안료 설치류에서 외과 의사 처음 sclera의 침투를 관찰할 수 있다 하지만 안료 맥락 막에 통로, 후 바늘 끝은 더 이상 표시. 직접 관찰 없이 망막 위배 일반적 이며 망막 해 부 및 세포 혈액의 유리 체에 배달 될 수 있습니다. 또한, 눈 표면 곡선 때문에 그것은 매우 어떤 바늘 각도 깊이 트랜스 scleral 주사에 대 한 가장 효과적인 알고 어렵다.

이 시각화 된 문서에서 정보를 가진 광학 일관성 단층 촬영 (OCT), 사출 사이트의 상세한 검사를 수 있는 수술 후 평가의 사용에 의해 트랜스 scleral subretinal 주입 방법을 소개 합니다. 우리의 트랜스 scleral 주입 기술 정의 위치, 각도, 그리고 매우 낮은 수술 외상 및 높은 신뢰성을 주사 바늘에 대 한 깊이 사용 합니다. 여기, 우리가 구체적으로 RCS 쥐, 인간의 AMD의 전 임상 모델의 subretinal 공간으로 hRPESC-RPE 세포의 주입을 보여 줍니다. 이 주입 방법으로 우리가 성공적으로 일관 되 게 배달 hRPESC-RPE 세포 RCS 쥐 눈 매우 높은 성공률의 subretinal 공간으로. 세포의 주입 이전¹³주입 후 최소 2 개월 RCS 대뇌의 보존을 발견 했다. 이 절차는 해 현미경 아래 수행 되 고 배우기 쉽습니다. 그것은 두 사람 (한 의사와 보조) 주사를 수행 요구 하 고 각 동물에 대 한 주입의 평균 시간은 5 분 미만 이다. 정의 된 각도 깊이 주사 바늘에 대 한 실험실, 10 월은 성공적인 subretinal 주입을 달성 하기 위해 사용할 수 없습니다에 대 한 가능 하 게. 그것은 높은 재현성 subretinal 액세스를 허용 하 고 세포 이식, 뿐만 아니라 약물 전달 및 유전자 치료에 사용할 수 있습니다.

Protocol

동물 관련 된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 뉴욕 주립 대학의 알바 니에 의해 승인 되었습니다. 1. 사전 사출 준비 HRPESC-RPE 세포 현 탁 액의 준비참고: 모든 다음 단계 살 균 조직 문화 후드에서 수행 됩니다 및 기본적인 살 균 기술 가진 친밀 필요 합니다. 기본 hRPE 세포 격리 인간 기증자에서 눈 세 50-90 년과 24-잘 접시<sup class…

Representative Results

이 문서에서 설명 하는 기술을 사용 하 여, 우리가 일관 되 게 배달 hRPESC-RPE 세포 RCS 쥐의 subretinal 공간으로 정확 하 게 위치, 각도, 그리고 조직 (그림 1B-D에 인젝터 바늘 삽입의 깊이 조절 하 여 ). 즉시 다음 이식, 10 월 시험 사출 사이트와 이식된 세포에 의해 만들어진 subretinal bleb을 수행 했다. 수술 후 10 월 평가 주사 및 망막 손상이 나 출혈에 대 …

Discussion

이 기사에서 묘사 된 subretinal 주입 기술은 트랜스 scleral 통로, 인젝터 바늘 신경 망막 손상 또는 유리 구멍을 방해 하지 않고 눈 벽의 바깥 레이어 (sclera-맥락 막-RPE 복잡 한)를 침투를 통해 이다. 대체 트랜스-vitreal 접근 설치류 렌즈 유리 구멍의 대부분을 차지 하는 때문에, 백 내장, 이어지는 렌즈 손상의 잠재적인 위험이 있다. 이 방법에 비해, 우리의 기술 덜 위험 하 고 인젝터 바늘 subretinal 공간?…

Materials

0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25200-072
DNAse I	Sigma	DN-25
1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF)	Corning Cellgro	431219
Sterile Balanced Salt Solution (BSS)	Alcon	00065079550
Sterile eye wash	Moore Medical	75519
Sterile 0.9% saline	Hospira	488810
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%)	Akorn	17478026312
Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%)	Bausch & Lomb	24208058559
Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock	Bausch & Lomb	42702010305	This is used to make 2.5% Phenylepherine
Buprenex	Patterson	433502
Dexamethasone	APP Pharmaceuticals	63323051610
100% Ethanol	Thermo Scientific	615090040
70% Ethanol	Ricca Chemical Company	2546.70-5
Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel	Novartis	78042947
Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops	Alcon	00065143105
hRPESC-RPE cells	Not available commercially		Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance.
24-well plates	Corning	3526
Conical tubes (15 ml)	Sarstedt	62554002
Microcentrifuge cap with o-ring	LPS inc	L233126
Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml)	LPS inc	L233041
Centrifuge	Eppendorf	5804R
Sterile alcohol wipe	McKesson	58-204
Sterile cotton tip applicators	McKesson	24-106-2S
Sterile Weck-Cel spears	Beaver-Visitec International	0008680
Sterile surgical drapes	McKesson	25-515
Gauze	McKesson	16-4242
Nanofil syringe (10 ul)	World Precision Instruments	Nanofil
Nanofil beveled 33-gauge needle	World Precision Instruments	NF33BV-2
Insulin syringe needles 31-gauge	Becton Dickinson	328418
Rat toothed forceps	World Precision Instruments	555041FT
Vannas Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz	RS-5602
Circulating water T pump	Stryker	TP700
Heating pad	Kent Scientific	TPZ-814
Animal anesthesia system	World Precision Instruments	EZ-7000
Balance	Ohaus	PA1502
Stereo microscope	Zeiss	Stemi 2000
Microscope light source	Schott	ACE series
Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System	Bioptigen	R2210
Sterile black marker pen	Viscot Industries	1416S-100
Miniature measuring scale	Ted Pella Inc	13623
Infrared Basking Spot Lamp	EXO-TERRA	PT2144	This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery  phase