軟骨再生のための3次元磁気幹細胞凝集およびバイオリアクター成熟
Summary
幹細胞から軟骨形成は、培養条件の微調整が必要です。ここで、我々は、細胞を集光するための軟骨形成を開始するために不可欠なステップを磁気アプローチを提示します。また、当社は、バイオリアクター内の動的成熟は、細胞の構造に機械的刺激を適用し、軟骨細胞外マトリックスの産生を増強することを示しています。
Abstract
軟骨工学は、ネイティブの組織に似たin vitro機能インプラントを作成するのが困難に起因する課題です。最近、自家代替品の開発のための探求のアプローチは、軟骨細胞への幹細胞の分化に関与します。この軟骨形成を開始するには、幹細胞の圧縮度が要求されます。したがって、我々は、細胞アトラクタとして小型化磁界源を使用して、厚い足場と足場フリー内の両方、磁気凝縮細胞の実現可能性を実証しました。この磁気アプローチはまた、凝集融合を誘導する足場を含まない構築するために使用される組織化、三次元（3D）のサイズの数ミリメートルを組織しました。強化されたサイズを有することに加えて、磁気駆動の融合によって形成された組織は、コラーゲンIIの発現の有意な増加を提示し、同様の傾向がアグリカン発現のために観察されました。ネイティブの軟骨が力トンに供した通り帽子は、その立体構造に影響を与えた、ダイナミックな成熟も行いました。機械的な刺激を提供するバイオリアクターは、21日間にわたって培養物に磁気播種足場を使用しました。バイオリアクターの成熟は、主として細胞化足場に軟骨形成を向上させます。これらの条件下で得られた細胞外マトリックスは、コラーゲンIIおよびアグリカンに富んでいました。この作業は、改善された軟骨形成分化、足場フリーの両方に多糖類の骨格内のバイオリアクター中で標識された幹細胞の磁気凝集及び動的成熟の革新的な可能性を概説します。
Introduction
磁性ナノ粒子は、既に磁気共鳴画像（MRI）用造影剤としてクリニックで使用されており、それらの治療への応用が拡大し続けます。例えば、最近、標識された細胞は、移植1、2、3の定義された部位に外部磁界を用いてin vivoで操作することができ、向けることができ、および/または維持することが示されています。再生医療において、それらは血管組織5、6、7、8、骨、および軟骨9を含むインビトロ 4 で編成組織を操作するために使用することができます。
関節軟骨は、損害が発生したときに、非常に限られた細胞外マトリックス成分の修理を行う、無血管環境に浸漬されます。このため、researc用時間は、現在、欠損部位に移植することができ硝子軟骨置換のエンジニアリングに焦点を当てています。他のものは軟骨12,13に分化する間葉系幹細胞（MSC）の能力を強調しながら、自己置換を生成するために、いくつかの研究グループは、セルソース10、11のような自家軟骨細胞の使用を模索しています。彼らの骨髄採取はかなりシンプルで、自分の表現型14を失う危険健全な軟骨細胞の犠牲を必要としないので、ここで再現した以前の研究では、我々は、MSCを選択しました。
幹細胞の軟骨形成分化を開始するために不可欠早い段階で彼らの結露です。細胞凝集体は、一般に遠心分離またはマイクロマス培養15のいずれかを用いて形成されています。しかし、これらの縮合方法neitheR厚い足場内の細胞クラスタを作成する可能性も凝集体の融合を制御する可能性を提示します。本稿では、MSC磁気標識及び磁気吸引力を利用した幹細胞を凝縮する革新的なアプローチについて説明します。この技術は、ミリメートルスケール軟骨組織9を得るために互いに凝集体の融合を介して足場フリー3D構築物を形成することが証明されています。厚いと大きな足場の磁気播種はまた、改変された組織のサイズを大きくする移植のためより容易に有用な形状を設計、および軟骨修復における臨床応用の可能性を多様化する可能性を可能にしました。ここでは、天然多糖類、プルラン、およびデキストランからなる多孔質足場にMSCの磁気シーディングのために、私たちの詳細プロトコルは、足場は以前幹細胞16、17を閉じ込めるために使用されます。軟骨形成分化がfinallましたyは細胞の高い密度で播種した足場のマトリックスコアに連続的な栄養素とガス拡散を確実にするために、バイオリアクターで行います。細胞に栄養、軟骨形成成長因子、およびガスを提供するだけでなく、バイオリアクターは、機械的刺激を提供しました。全体として、バイオリアクター内で動的成熟と組み合わされた幹細胞を閉じ込めるために使用される磁気技術は、著しく軟骨形成分化を向上させることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで紹介するテクニックは、磁性ナノ粒子の内在化に依存しているため、彼らは、細胞内局在したらまず、一つの重要な問題は、ナノ粒子の結果です。鉄ナノ粒子は、それらのサイズ、コーティング、及び露光19の時間に応じて潜在的な毒性または障害分化能力、22をトリガすることができることは事実です。カプセル化された鉄ナノ粒子は、マ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、バイオリアクターでの彼らの助けのためにQuinXell技術とCellD、特にロサー・グランマンとドミニーク・ゴーズラン確認したいと思います。私たちは、プルラン/デキストラン多糖類の足場を提供してくれキャサリンルヴィサージュを、感謝します。この作品は、欧州連合（ERC-2014-重心プロジェクトマティス648779）によっておよびAgenceNationaledeラRECHERCHE（ANR）、フランス（MagStemプロジェクトANR-11 SVSE5）によってサポートされていました。
Materials
| Iron oxide (maghemite) nanoparticules ( γ-Fe2O3) | PHENIX – University Paris 6 | Made and given by C. Ménager | Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge |
| Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds | LIOAD – University Nantes | Made and given by C. Le Visage | Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10M NaOH). Porosity: 185-205µm; Thickness: 7mm; Surface area: 1.8cm2. |
| TisXell Regeneration System | QuinXell Technologies | QX900-002 | Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber |
| Cage for scaffolds: Histosette II M492 | VWR | 720-0909 | |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | Three independant batches have been used |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| TGF-beta 3 protein 10µg | Interchim | 30R-AT028 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare the 1M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus | Sigma | P2986 | |
| Dextranase from Chaetomium erraticum | Sigma | D0443 | |
| NucleoSpin RNA Extraction Kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| Random Primer – Hexamer | Promega | C1181 | 500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample |
| Recombinant RNAsin ribonuclease inhibitor | Promega | N2511 | 40 U/µL: put 1 µL per sample |
| PCR nucleotide dNTP mix (10mM each) | Roche | 10842321 | |
| SyBr Green PCR Master Mix | Life Technologies | 4368708 | |
| Step One Plus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4381792 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| OCT solution | VWR | 361603E | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Toluidine blue O | VWR | 1.15930.0025 | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Toluene | VWR | 1.08323.1000 | |
| Mounting medium Pertex | Histolab | 840 | |
| RPLP0 Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3' ; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3' |
|
| Aggrecan Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3' ; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5' | |
| Collagen II Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3' ; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5' |
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