3D Magnetisk Stem Cell Aggregation og bioreaktor Modning for Brusk Regeneration
Summary
Brusk fra stamceller krever finjustering av kulturbetingelsene. Her presenterer vi en magnetisk metode for kondensering av celler, til et viktig skritt initiere bruskdannelse. I tillegg, viser vi at dynamisk modning i en bioreaktor gjelder mekanisk stimulering til de cellulære konstruksjonene og forbedrer brusk ekstracellulær matriksproduksjon.
Abstract
Brusk teknikk er fortsatt en utfordring på grunn av vanskelighetene med å skape en in vitro-funksjonell implantatet lik den opprinnelige vev. En tilnærming har nylig undersøkt for utvikling av autologe erstatninger innebærer differensiering av stamceller til kondrocytter. For å initiere denne bruskdannelse, en komprimeringsgrad av stamceller er nødvendig; derav, demonstrerte vi muligheten for magnetisk kondenserende celler, både innenfor tykke stillaser og stillas for, bruk av minimalimagnetfeltkilder for eksempel base tiltrekkere. Denne magnetiske fremgangsmåte ble også benyttet for å lede aggregat fusjon og for å bygge stillas-fri, organisert, tre-dimensjonale (3D) vev flere millimeter i størrelse. I tillegg til å ha en øket størrelse, det vev som dannes ved en magnetisk drevet fusjon presenterte en signifikant økning i ekspresjonen av kollagen II, og en lignende tendens ble observert for aggrecan ekspresjon. Som det native brusk ble utsatt for krefter that påvirket sin 3D-struktur, dynamisk modning ble også utført. En bioreaktor som gir mekaniske stimuli ble anvendt for å dyrke de magnetisk seeded stillasene i løpet av en periode på 21 dager. Bioreaktor modning i stor grad forbedret brusk inn i cellularized stillasene; den ekstracellulære matriks oppnådd under disse betingelser var rik på kollagen II og aggrecan. Dette arbeid beskriver nyskapende potensial av magnetisk kondensering av merkede stamceller og dynamisk modning i en bioreaktor for forbedret chondrogen differensiering, både uten stillas og innenfor polysakkarid stillaser.
Introduction
Magnetiske nanopartikler er allerede anvendt i klinikken som kontrastmidler for magnetisk resonansavbildning (MRI), og deres terapeutiske anvendelser at utvidelsen. For eksempel har det nylig vært vist at merkede celler kan bli manipulert in vivo ved anvendelse av et eksternt magnetfelt og kan rettes og / eller opprettholdt på et definert sete implantasjonsstedet 1, 2, 3. I regenerativ medisin, kan de brukes til å konstruere organiserte vev in vitro 4, deriblant vaskulære vev 5, 6, 7, 8 ben, brusk og 9.
Artikulær brusk er nedsenket i en avaskulær miljø, noe som gjør reparasjon av ekstracellulære matrikskomponenter meget begrenset når skader oppstår. Av denne grunn, research er for tiden rettet mot konstruksjon av hyalinbrusk erstatninger som kan bli implantert på det defekte område. For å fremstille en autolog erstatning, er noen forskningsgrupper utforsker bruken av autologe kondrocytter som en celle kilde 10, 11, mens andre understreke kapasiteten av stamceller (MSC) til å differensiere til kondrocytter, 12, 13. I tidligere studier rekapitulert her, valgte vi MSC, som deres benmarg prøvetaking er ganske enkel og krever ikke offer av sunne chondrocytes, som risikerer å miste sin fenotype 14.
En tidlig trinn nødvendig for å initiere chondrogen differensiering av stamceller er deres kondensering. Celleaggregater dannes vanligvis ved anvendelse av enten sentrifugering eller Micromass kultur 15; Men disse kondensasjonsprodukter metoder neither presentere potensial til å lage cellegrupper innenfor tykke stillaser og heller ikke mulighet for å styre sammensmelting av aggregater. I denne artikkelen beskriver vi en nyskapende fremgangsmåte for kondensering av stamceller ved å bruke MSC magnetisk merking og magnetisk tiltrekning. Denne teknikken har vist seg å danne stillasfritt 3D konstruksjoner via fusjon av aggregater med hverandre for å oppnå en millimeter skala bruskvevet 9. Magnetisk såing av tykke og store stillaser har også gitt mulighet for å øke størrelsen på den manipulerte vev, å utforme en form som lettere anvendbare for implantering, og en spredning av potensialet for kliniske anvendelser i bruskreparasjon. Her har vi detalj protokollen for den magnetiske såing av MSC til porøse stillas består av naturlige polysakkarider, pullulan, dekstran og, stillaser som tidligere ble brukt for å begrense stamceller 16, 17. Chondrogen differensiering var finally utført i en bioreaktor for å sikre kontinuerlig næringsstoff og gass diffusjon inn i matrikskjernen av stillasene podet med en høy tetthet av celler. Foruten næringsstoffer, chondrogen vekstfaktorer og gass til cellene, bioreaktoren tilbys mekanisk stimulering. Totalt sett er magnetiske teknologien som brukes for å begrense stamceller, kombinert med dynamisk modning i en bioreaktor, kan betydelig forbedre chondrogen differensiering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Først fordi de teknikkene som presenteres her er avhengige av internalisering av magnetiske nanopartikler, er en viktig sak utfallet av nanopartikler når de lokaliseres inne i cellene. Det er sant at jern nanopartikler kan utløse potensiell toksisitet, eller nedsatt differensieringskapasitet, avhengig av deres størrelse, belegg, og tiden for eksponering 19, 22. Imidlertid har flere studier vist noen effekt på cellulær fysiologi når innkapslede jernnanopar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å erkjenne QuinXell Technologies og CellD, særlig Lothar Grannemann og Dominique Ghozlan for deres hjelp med bioreaktor. Vi takker Catherine Le Visage, som ga oss med pullulan / dekstran polysakkarid stillaser. Dette arbeidet ble støttet av EU (ERC-2014-Cog prosjekt Matisse 648 779) og ved AgenceNationalede la Recherche (ANR), Frankrike (MagStem prosjekt ANR-11 SVSE5).
Materials
| Iron oxide (maghemite) nanoparticules ( γ-Fe2O3) | PHENIX – University Paris 6 | Made and given by C. Ménager | Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge |
| Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds | LIOAD – University Nantes | Made and given by C. Le Visage | Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10M NaOH). Porosity: 185-205µm; Thickness: 7mm; Surface area: 1.8cm2. |
| TisXell Regeneration System | QuinXell Technologies | QX900-002 | Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber |
| Cage for scaffolds: Histosette II M492 | VWR | 720-0909 | |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | Three independant batches have been used |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| TGF-beta 3 protein 10µg | Interchim | 30R-AT028 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare the 1M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus | Sigma | P2986 | |
| Dextranase from Chaetomium erraticum | Sigma | D0443 | |
| NucleoSpin RNA Extraction Kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| Random Primer – Hexamer | Promega | C1181 | 500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample |
| Recombinant RNAsin ribonuclease inhibitor | Promega | N2511 | 40 U/µL: put 1 µL per sample |
| PCR nucleotide dNTP mix (10mM each) | Roche | 10842321 | |
| SyBr Green PCR Master Mix | Life Technologies | 4368708 | |
| Step One Plus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4381792 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| OCT solution | VWR | 361603E | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Toluidine blue O | VWR | 1.15930.0025 | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Toluene | VWR | 1.08323.1000 | |
| Mounting medium Pertex | Histolab | 840 | |
| RPLP0 Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3' ; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3' |
|
| Aggrecan Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3' ; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5' | |
| Collagen II Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3' ; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5' |
References
- Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. Clinical imaging in regenerative medicine. Nat Biotechnol. 32 (8), 804-818 (2014).
- Edmundson, M., Thanh, N. T., Song, B. Nanoparticles based stem cell tracking in regenerative medicine. Theranostics. 3 (8), 573-582 (2013).
- Di Corato, R., et al. High-resolution cellular MRI: gadolinium and iron oxide nanoparticles for in-depth dual-cell imaging of engineered tissue constructs. ACS Nano. 7 (9), 7500-7512 (2013).
- Xu, F., et al. Three-dimensional magnetic assembly of microscale hydrogels. Adv Mater. 23 (37), 4254-4260 (2011).
- Kito, T., et al. iPS cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for reparative angiogenesis. Sci Rep. 3, 1418 (2013).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Nanotechnology in vascular tissue engineering: from nanoscaffolding towards rapid vessel biofabrication. Trends Biotechnol. 26 (6), 338-344 (2008).
- Mattix, B. M., et al. Janus magnetic cellular spheroids for vascular tissue engineering. Biomaterials. 35 (3), 949-960 (2014).
- Henstock, J., El Haj, A. Controlled mechanotransduction in therapeutic MSCs: can remotely controlled magnetic nanoparticles regenerate bones?. Regen Med. 10 (4), 377-380 (2015).
- Fayol, D., et al. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Adv Mater. 25 (18), 2611-2616 (2013).
- Bartlett, W., et al. Autologous chondrocyte implantation versus matrix-induced autologous chondrocyte implantation for osteochondral defects of the knee: a prospective, randomised study. J Bone Joint Surg Br. 87 (5), 640-645 (2005).
- Batty, L., Dance, S., Bajaj, S., Cole, B. J. Autologous chondrocyte implantation: an overview of technique and outcomes. ANZ J Surg. 81, 18-25 (2011).
- Song, L., Baksh, D., Tuan, R. S. Mesenchymal stem cell-based cartilage tissue engineering: cells, scaffold and biology. Cytotherapy. 6 (6), 596-601 (2004).
- Boeuf, S., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells: role of tissue source and inducing factors. Stem Cell Res Ther. 1 (4), 31 (2010).
- Kock, L., van Donkelaar, C. C., Ito, K. Tissue engineering of functional articular cartilage: the current status. Cell Tissue Res. 347 (3), 613-627 (2012).
- Schon, B. S., et al. Validation of a high-throughput microtissue fabrication process for 3D assembly of tissue engineered cartilage constructs. Cell Tissue Res. , (2012).
- Robert, D., et al. Magnetic micro-manipulations to probe the local physical properties of porous scaffolds and to confine stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1586-1595 (2010).
- Luciani, N., et al. Successful chondrogenesis within scaffolds, using magnetic stem cell confinement and bioreactor maturation. Acta Biomaterialia. 37, 101-110 (2016).
- Wilhelm, C., Gazeau, F. Universal cell labelling with anionic magnetic nanoparticles. Biomaterials. 29 (22), 3161-3174 (2008).
- Fayol, D., Luciani, N., Lartigue, L., Gazeau, F., Wilhelm, C. Managing magnetic nanoparticle aggregation and cellular uptake: a precondition for efficient stem-cell differentiation and MRI tracking. Adv Healthc Mater. 2 (2), 313-325 (2013).
- Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. Eur Biophys J. 31 (2), 118-125 (2002).
- Autissier, A., Le Visage, C., Pouzet, C., Chaubet, F., Letourneur, D. Fabrication of porous polysaccharide-based scaffolds using a combined freeze-drying/cross-linking process. Acta Biomater. 6 (9), 3640-3648 (2010).
- Singh, N., Jenkins, G. J. S., Asadi, R., Doak, S. H. Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Reviews. 1, (2010).
- Lee, J. H., Hur, W. Scaffold-free formation of a millimeter-scale multicellular spheroid with an internal cavity from magnetically levitated 3T3 cells that ingested iron oxide-containing microspheres. Biotechnol Bioeng. 111 (5), 1038-1047 (2014).
- Mattix, B., et al. Biological magnetic cellular spheroids as building blocks for tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10 (2), 623-629 (2014).
- Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
- Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
- Shimizu, K., Ito, A., Honda, H. Enhanced cell-seeding into 3D porous scaffolds by use of magnetite nanoparticles. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 77 (2), 265-272 (2006).
- Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine (Lond). 7 (9), 1425-1442 (2012).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur Cell Mater. 13, 66-74 (2007).
- Takahashi, I., et al. Compressive force promotes sox9, type II collagen and aggrecan and inhibits IL-1beta expression resulting in chondrogenesis in mouse embryonic limb bud mesenchymal cells. J Cell Sci. 111 (14), 2067-2076 (1998).
- Campbell, J. J., Lee, D. A., Bader, D. L. Dynamic compressive strain influences chondrogenic gene expression in human mesenchymal stem cells. Biorheology. 43, 455-470 (2006).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. J Orthop Res. 17 (1), 130-138 (1999).
