Stimulatie van Notch signalering in Mouse osteoclastvoorlopers

Summary

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

Abstract

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state.

Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.

This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Introduction

Het zoogdier Notch signaling pathway homoloog dezelfde route in Drosophila melanogaster en bestaat uit vier transmembraan Notch receptoren (Notch1-4) en vijf membraangebonden liganden van de Jagged (JAG1 & JAG2) en Delta-achtige (DLL1, 3, en 4) gezinnen ^1. Notch signalering wordt gestart wanneer Notch receptor op een ontvangende cel door ligand is gebonden aan een zendende cel ^2. Tijdens deze trans-activatie, de membraangebonden Notch ligand produceert een rekkracht op de membraangebonden Notch receptor ^{3, 4.} De rekkracht van ligand binding induceert conformatieveranderingen in de Notch receptor die extracellulaire splitsing van de receptor vergemakkelijken door TNFa omzettend enzym (TACE), gevolgd door een intracellulaire splitsing gebeurtenis gemedieerd door een preseniline bevattende gamma-secretase complex (γ-secretase). γ-secretase releases de Notch intracellular domein (NiCd) die transloceert naar de kern waar het een complex met transcriptionele activatie CBF-1-Su (H) -Lag-1 (CSL), brein-achtige (MAML) en celtype-specifieke factoren heeft expressie van target genen ^5.

De mechanische elementen van Notch activatie leiden tot de noodzaak van unieke methoden Notch pathway activatie in vitro. Oplosbare Notch liganden binden aan receptoren Notch, maar niet de productie strekkrachten noodzakelijk NiCd afgifte terwijl tegelijkertijd de competitieve inhibitie van binding van cel-geassocieerd Notch ligands. Zo, de toevoeging van oplosbare Notch liganden aan kweekmedium kunnen normale Notch signalering ^{6, 7} verzwakken. Gelukkig kunnen Notch ligands NiCd afgifte veroorzaken als ze worden bevestigd aan een geschikt stijf substraat ^{5, 8, 9,10.} Zaaien cellen op kweek-ligand gecoate substraten of toepassing-ligand gecoate kralen om cellen kunnen activeren zowel Notch signalering, en de keuze daartussen vooral afhankelijk van de gewenste timing van Notch stimulatie. Voor onmiddellijke, tijdelijke Notch activatie als gewenst zou zijn in het midden van een functionele assay of differentiatie, Notch ligand kan gebonden worden aan kralen, toegepast op gekweekte cellen agarose en uitgewassen op elk moment. Langduriger Notch signalering vanaf het begin van de kweekperiode, kan weefselkweekplaten worden bekleed met ligand voorafgaand aan zaaien van cellen.

Voor de toepassing van dit protocol, worden werkwijzen uitgevoerd met muis osteoclastvoorlopers, maar de werkwijzen en variaties op de hier beschreven werkwijzen zijn toepasbaar op een breed scala aan celtypen ^{6, 11, 12, 13,} </sup> ^14. Osteoclasten terminaal gedifferentieerde hematopoëtische afstamming, cellen die verantwoordelijk zijn voor de resorptie van botweefsel zijn, en ze zijn betrokken bij verschillende aandoeningen van botverlies ^15. Dus in vitro onderzoek van de differentiatie van osteoclasten uit hun monocyt / macrofaag-lijn precursoren en de moleculaire mechanismen die de functie moet beter begrip van osteoclasten en de ontwikkeling van nieuw bot regenereren therapieën. Hoewel wordt nu algemeen aanvaard dat Notch een positieve rol bij de differentiatie en functie van osteoclasten speelt, variaties in zowel Notch stimulatie en osteoclast precursor cultuur en differentiatie tot oorspronkelijk tegenstrijdige bevindingen ^{16, 17, 18, 19.} Nadere bestudering van de verschillen in methoden en het gebruik van genetischemodellen zijn sterk verduidelijkt de rol van Notch in osteoclasten, maar toepassing van gestandaardiseerde Notch stimulatie en kweekwerkwijzen kunnen dergelijke controversen in toekomstige studies van Notch in andere celtypes ^{20, 21, 22, 23} te voorkomen.

Er zijn meerdere werkwijzen voor het kweken en differentiëren muis osteoclastvoorlopers, en zoals met uiteenlopende werkwijzen voor het stimuleren Notch signalering, de beste methode afhangen van de wetenschappelijke vraag. Hierin zal onze manier van kweken van hechtende en niet-hechtende fracties van beenmerg cellen gespoeld uit muizen lange beenderen voorkeur worden gepresenteerd. Deze werkwijze heeft het voordeel van in wezen waarvoor geen gespecialiseerde uitrusting en cellen die van toepassing zijn op verschillende differentiatiemethoden zijn.

Protocol

Al het onderzoek met gewervelde dieren werd uitgevoerd in overeenstemming met protocollen die door de Universiteit van Pennsylvania Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) goedgekeurd. 1. Cultuur Mediavoorbereiding Bereid α-MEM door oplossen minimaal essentieel medium (MEM) poeder en 1,9 g natriumbicarbonaat in 900 ml H2O en aangevuld met 2 mM L-glutamine, 100 eenheden / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, en 100 ml warmte- geïnactiveerd foetaal run…

Representative Results

Het doel van deze methode is de cultuur en stimuleren Notch signalering bij osteoclastvoorlopers. Wanneer behoorlijk beschaafd, osteoclastvoorlopers vertonen vooral een langgerekte spoelvormige morfologie met gladde cytoplasma (Figuur 1A). Zorg moet worden genomen om immunologische activatie van de osteoclastprecursors voorkomen. Na activering voorlopers verspreiden en afgevlakt met schuimende cytoplasma (Figuur 1B). Deze "gebakken ei" cellen z…

Discussion

Kritische stappen in het protocol

Cultuur en in vitro differentiatie van osteoclastprecursors een nuttig platform voor onderzoek naar de moleculaire mechanismen van osteoclastogenese en de identificatie van therapeutische targets voor bot regeneratie en behoud van botmassa. Bij het kweken van muis osteoclastvoorlopers, de meest kritische element is het onderhoud van voorlopers in een naïeve staat. Als macrofaag-achtige cellen zijn osteoclastvoorlopers geprimed reactie op bacteriële b…

Materials

Recombinant mouse M-CSF	Biolegend	576402	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant mouse RANKL	Shenandoah Biotechnology	200-04	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant human Jagged1-Fc	R&D Systems	1277-JG-050	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Protein G agarose beads	InvivoGen	gel-agg-2
Goat anti-human IgG Fc	Jackson ImmunoResearch	109-001-008
Minimum Essential Medium powder	Sigma-Aldrich	M0894
Accutase cell dissociation reagent	ThermoFisher	A1110501	Used to lift osteoclast precursors
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit	Sigma-Aldrich	387A-1KT	Used to stain differentiated osteoclasts