גירוי של מערכת איתות Notch עכבר osteoclast המבשר

Summary

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

Abstract

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state.

Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.

This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Introduction

מסלול איתות Notch היונק הוא הומולוגי לאותו המסלול ב תסיסנית והיא מורכבת מארבעה קולטנים Notch הטרנסממברני (Notch1-4) וחמישה הליגנדים קרום נכנס של Jagged (JAG1 & JAG2) ודלתא הדמוית (DLL1, 3, & 4) משפחות ^1. איתות Notch מופעלת כאשר הקולטן Notch על תא מקבל מחויב ליגנד על תא שידור ^2. במהלך הפעלה טראנס זה, ליגנד Notch הקרום נכנס מייצר כוח מתיחה על קולט Notch הקרום נכנס ^{3, 4.} הכח המתיח של ליגנד מחייב גורם לשינויי קונפורמציה הקולטן Notch המאפשרים מחשופות תאים של הקולטן על ידי TNFalpha המרת אנזים (TACE) ואחריו אירוע מחשוף תאיים מתווך על ידי גמא-secretase המכיל presenilin המורכב (γ-secretase). γ-secretase ומשחרר את Notch intתחום racellular (NiCd) אשר translocates לתוך הגרעין בו צורות מתחם הפעלה תעתיק עם CBF-1-סו (H) -Lag-1 (CSL), המוח דמוי (maml), וגורמים סוג תא ספציפי לנהוג ביטוי של למקד גנים ^5.

האלמנטים המכאניים של תוצאת הפעלת איתות Notch בצורך השיטות ייחודיות של הפעלת מסלול Notch במבחנה. הליגנדים Notch מסיסים יכולים להיקשר Notch קולטנים, אבל לא מצליחים לייצר מתיחה הכוחות הדרושים לשחרור NiCd ובאותו זמן עיכוב תחרותי מחייב של הליגנדים Notch הקשורים התא. לפיכך, תוספת של הליגנדים Notch מסיסים עד בינוני התרבות יכולה להחליש Notch הנורמלי איתות ^{6, 7.} למרבה המזל, הליגנדים Notch יכול לגרום לשחרור NiCd אם הם קבועים כדי מצע קשיח כראוי ^{5, 8, 9,10.} זריעת תאים על מצעים תרבות מצופה ליגנד או החלת חרוזים מצופים ליגנד לתאים שניהם יכולים להפעיל Notch signaling, והבחירה ביניהן תלויה בעיקר בתזמון הרצוי של גירוי Notch. להגברת פעילות איתות Notch מיידית, זמנית, כפי שניתן היה רצוי במהלך האמצע של assay תפקודית או בידול, ליגנד Notch יכול להיות מאוגד agarose חרוזים, הוחלו תאים בתרבית, ו סחוט בכל עת. לאיתות Notch מתמשכת יותר מתחילת תקופת תרבות, צלחות בתרבית רקמה יכולות להיות מצופות ליגנד לפני זריעת תאים.

למטרות פרוטוקול זה, שיטות מתבצעות באמצעות מבשרי osteoclast העכבר, אבל שיטות וריאציות על השיטות שתוארו כאן ישימות למגוון רחב של סוגי תאים ^{6, 11, 12, 13,} </sup> ^14. Osteoclasts הם סופני תאי linage hematopoietic הבדילו כי האחראים הספיגים של רקמת עצם, והם מעורבים בהפרעות מרובות של עצם פסד ^15. לפיכך, במחקר במבחנה של הבידול של osteoclasts מ מבשר מונוציטים / מקרופאג השושלת שלהם ואת המנגנונים המולקולריים השולטים תפקידם חיוני להבנה טובה יותר של osteoclasts ופיתוח של טיפולי עצם התחדשות חדשים. ואילו כיום הוא מקובלים כי איתות Notch ממלאת תפקיד חיוב הבידול והתפקוד של osteoclasts, וריאציות בשתי תרבות מבשר Notch איתות גירוי osteoclast וההבחנה הובילו לממצאים סותרים בתחילה ^{16, 17, 18, 19.} בדיקה מדוקדקת יותר של ההבדלים בשיטות ושימוש גנטייםמודלים מאוד הבהירו את התפקיד של Notch איתות osteoclastogenesis, אבל יישום של שיטות התרבות וגירוי Notch סטנדרטיות יכול למנוע מחלוקות כאלה במחקרים עתידיים של Notch איתות סוגי תאים אחרים ^{20, 21, 22, 23.}

ישנן מספר שיטות culturing ומבדל מבשרי osteoclast העכבר, וכמו עם שיטות שונות עבור מגרת Notch signaling, השיטה הטובה ביותר תהיה תלויה בשאלה הניסיונית. בזאת, השיטה המועדפת עלינו culturing שברים חסידים לא חסידים של תאי מח הסמוקים מן העצמות ארוכות עכבר יוצגה. שיטה זו יש יתרון בכך שנדרש למעשה שום ציוד מיוחד והפקת תאים החלימו על מגוון של שיטות בידול.

Protocol

כל המחקר מעורב בעלי חיים בעלי חוליות בוצע בהתאם פרוטוקולים שאושרו על ידי האוניברסיטה של ​​טיפול בבעלי החיים המוסדי פנסילבניה ועדת שימוש (IACUC). 1. הכנת מדיה ותרבות הכן α-MEM ידי המסת …

Representative Results

מטרת השיטה היא התרבות לעורר Notch איתות מבשר osteoclast. כאשר כראוי תרבותי, מבשרי osteoclast להפגין מורפולוגיה ציר בצורה מוארכת בעיקר עם הציטופלסמה חלקה (איור 1 א). יש להקפיד כדי להימנע מהפעלת אימונולוגיים של מבשרי osteoclast. לאחר ההפעלה, מבשרי להתפשט ולהפו?…

Discussion

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול

תרבות בידול במבחנה של מבשרי osteoclast מספקת פלטפורמה שימושית לחקירה של מנגנונים מולקולריים של osteoclastogenesis וזיהוי מטרות טיפוליות עבור התחדשות עצם ושימור מסת עצם. כאשר culturing מבשר osteoclast העכבר, האלמנט הקר?…

Materials

Recombinant mouse M-CSF	Biolegend	576402	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant mouse RANKL	Shenandoah Biotechnology	200-04	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant human Jagged1-Fc	R&D Systems	1277-JG-050	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Protein G agarose beads	InvivoGen	gel-agg-2
Goat anti-human IgG Fc	Jackson ImmunoResearch	109-001-008
Minimum Essential Medium powder	Sigma-Aldrich	M0894
Accutase cell dissociation reagent	ThermoFisher	A1110501	Used to lift osteoclast precursors
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit	Sigma-Aldrich	387A-1KT	Used to stain differentiated osteoclasts