माउस अस्थिशोषक व्यापारियों में पायदान संकेतन की उत्तेजना
Summary
Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.
Abstract
Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state.
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.
Introduction
स्तनधारी पायदान संकेतन मार्ग ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में एक ही मार्ग के मुताबिक़ है और चार transmembrane पायदान रिसेप्टर्स (Notch1-4) और दांतेदार (JAG1 और JAG2) और डेल्टा की तरह (DLL1, 3 के पांच झिल्ली ही सीमित ligands के होते हैं, और 4) परिवारों को 1। जब एक प्राप्त सेल पर पायदान रिसेप्टर एक संचारण सेल 2 पर ligand से बाध्य है पायदान संकेतन शुरू की है। इस पार सक्रियण के दौरान, झिल्ली ही सीमित पायदान ligand झिल्ली ही सीमित पायदान रिसेप्टर 3, 4 पर एक खींच बल पैदा करता है। ligand बाध्यकारी की खींच बल पायदान रिसेप्टर में गठनात्मक परिवर्तन है कि TNFalpha द्वारा रिसेप्टर के बाह्य दरार की सुविधा परिवर्तित एंजाइम (TACE) एक presenilin युक्त गामा secretase परिसर (γ-secretase) द्वारा मध्यस्थता एक intracellular दरार घटना के द्वारा पीछा लाती है। γ-secretase विज्ञप्ति पायदान intracellular डोमेन (एनआईसीडी) जो नाभिक जहां यह CBF-1-र (एच) -Lag-1 (सीएसएल), मास्टरमाइंड की तरह (MAML) के साथ एक transcriptional सक्रियण जटिल रूपों में translocates, और सेल प्रकार विशिष्ट कारकों अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए के जीन 5 लक्ष्य।
इन विट्रो में पायदान मार्ग सक्रियण की अनूठी तरीकों के लिए जरूरत होती पायदान संकेतन सक्रियण परिणाम के यांत्रिक तत्वों। घुलनशील पायदान ligands रिसेप्टर्स पायदान के लिए बाध्य है, लेकिन एनआईसीडी रिहाई के लिए आवश्यक बलों खींच जबकि एक ही समय में प्रतिस्पर्धात्मक रूप से सेल जुड़े पायदान ligands के बंधन में बाधा का उत्पादन करने में असफल हो सकता है। इस प्रकार, संस्कृति के माध्यम से घुलनशील पायदान ligands के अलावा सामान्य पायदान 6, 7 संकेत attenuate कर सकते हैं। सौभाग्य से, पायदान ligands एनआईसीडी रिहाई के लिए प्रेरित कर सकते हैं अगर वे एक उपयुक्त कठोर सब्सट्रेट 5, 8, 9 को तय कर रहे हैं,10। ligand लेपित संस्कृति substrates पर कोशिकाओं सीडिंग या कोशिकाओं के लिए ligand लिपटे मोतियों को लागू करने के लिए दोनों पायदान संकेतन सक्रिय कर सकते हैं, और उन दोनों के बीच चुनाव पायदान उत्तेजना के वांछित समय पर मुख्य रूप से निर्भर करता है। तत्काल, अस्थायी पायदान संकेतन सक्रियण के लिए, के रूप में एक कार्यात्मक या भेदभाव परख के मध्य के दौरान वांछित किया जाएगा, पायदान ligand मोती, सुसंस्कृत कोशिकाओं को लागू agarose के लिए बाध्य किया जा सकता है, और किसी भी समय बाहर धोया। एक संस्कृति अवधि की शुरुआत से अधिक निरंतर पायदान संकेतन के लिए, टिशू कल्चर प्लेटों ligand सेल बोने से पहले साथ लेपित किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल के प्रयोजनों के लिए, विधियों माउस अस्थिशोषक व्यापारियों का उपयोग किया जाता है, लेकिन तरीकों और यहाँ वर्णित तरीकों में बदलाव सेल प्रकार 6, 11, 12, 13 की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू कर रहे हैं, </sup> 14। अस्थिशोषकों टर्मिनली विभेदित hematopoietic वंशावली कोशिकाओं है कि हड्डी के ऊतकों के अवशोषण के लिए जिम्मेदार हैं, और वे हड्डी हानि 15 के कई विकारों में फंसा रहे हैं। इस प्रकार, उनके monocyte / बृहतभक्षककोशिका वंश व्यापारियों से अस्थिशोषकों और आणविक को नियंत्रित करने के उनके कार्य अस्थिशोषकों और नई हड्डी-regenerating उपचारों के विकास की बेहतर समझ के लिए आवश्यक है तंत्र के भेदभाव के इन विट्रो अध्ययन में। यह अब आम तौर पर स्वीकार किया जाता है जबकि उस पायदान संकेतन भेदभाव और अस्थिशोषकों के समारोह में एक सकारात्मक भूमिका निभाता है, दोनों पायदान संकेतन उत्तेजना और अस्थिशोषक अग्रदूत संस्कृति और भेदभाव में बदलाव शुरू में विरोधाभासी निष्कर्षों 16, 17, 18, 19 के लिए नेतृत्व किया। तरीकों में मतभेद के करीब परीक्षा और आनुवंशिक का उपयोगमॉडल बहुत osteoclastogenesis में पायदान संकेतन की भूमिका स्पष्ट किया है, लेकिन मानकीकृत पायदान उत्तेजना और संस्कृति तरीकों के आवेदन अन्य प्रकार की कोशिकाओं 20, 21, 22, 23 में पायदान संकेतन के भविष्य के अध्ययनों में इस तरह के विवादों को रोकने सकता है।
वहाँ संवर्धन और माउस अस्थिशोषक व्यापारियों फर्क के लिए कई तरीके हैं, और, पायदान संकेतन उत्तेजक के लिए अलग-अलग तरीकों के साथ के रूप में, सबसे अच्छा तरीका प्रयोगात्मक प्रश्न पर निर्भर करेगा। इस के साथ साथ, माउस लंबी हड्डियों से प्लावित मज्जा कोशिकाओं के पक्षपाती और गैर पक्षपाती अंशों संवर्धन के हमारे पसंदीदा विधि प्रस्तुत किया जाएगा। इस विधि को अनिवार्य रूप से कोई विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है और कोशिकाओं है कि भेदभाव तरीकों की एक किस्म के लिए लागू कर रहे हैं उत्पादन का लाभ दिया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
संस्कृति और अस्थिशोषक व्यापारियों की इन विट्रो भेदभाव में osteoclastogenesis और हड्डी उत्थान और हड्डियों के संरक्षण के लिए चिकित्सकीय लक्ष्यों की पहचान के आणव?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the University of Pennsylvania Center for Musculoskeletal Disorders (5 P30 AR050950-09), a grant from the AO Foundation (S-16-12A), the Philadelphia VA Medical Center Translational Musculoskeletal Research Center, and an intramural orthopaedic surgery departmental research development fund. JWA is supported by the University of Pennsylvania Postdoctoral Opportunities in Research and Teaching (PENN-PORT) fellowship funded by the National Institute of General Medical Sciences Institutional Research and Career Development Award (IRACDA; 5 K12 GM081259-08).
Materials
| Recombinant mouse M-CSF | Biolegend | 576402 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant mouse RANKL | Shenandoah Biotechnology | 200-04 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant human Jagged1-Fc | R&D Systems | 1277-JG-050 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Protein G agarose beads | InvivoGen | gel-agg-2 | |
| Goat anti-human IgG Fc | Jackson ImmunoResearch | 109-001-008 | |
| Minimum Essential Medium powder | Sigma-Aldrich | M0894 | |
| Accutase cell dissociation reagent | ThermoFisher | A1110501 | Used to lift osteoclast precursors |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | Used to stain differentiated osteoclasts |
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