マウスの破骨細胞前駆体におけるNotchシグナル伝達の刺激
Summary
Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.
Abstract
Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state.
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.
Introduction
哺乳類のNotchシグナル伝達経路は、 キイロショウジョウバエで同じ経路に相同であり、4つの膜貫通Notch受容体（Notch1-4）とジャグ（JAG1＆JAG2）とデルタ様（DLL1、3の5膜結合リガンドで構成されてい＆ 4）家族1。受容細胞のNotch受容体は、送信セル2のリガンドによって結合されるときに、ノッチシグナリングが開始されます。このトランス活性化の際に、膜結合Notchリガンドは、膜結合型Notch受容体3,4の伸縮力を生成します。リガンド結合の伸縮力は、プレセニリン含有γ-セクレターゼ複合体（γセクレターゼ）によって媒介される細胞内切断事象に続く変換酵素（TACE）TNFアルファによる受容体の細胞外切断を促進するNotch受容体の立体構造変化を誘導します。 γセクレターゼのリリースノッチint型それはCBF-1-蘇（H）-Lag-1（CSL）、首謀者様（MAML）と転写活性化複合体を形成する核に移行し、細胞型特異的因子の発現を駆動するracellularドメイン（NICD）標的遺伝子5の。
インビトロでの Notch経路活性化の独特な方法が必要でNotchシグナル伝達活性化の結果の機械要素。可溶性Notchリガンドは、受容体のNotchに結合するが、同時に競合的に細胞関連Notchリガンドの結合を抑制しつつ、NICDのリリースのために必要な伸縮力を生成するために失敗することがあります。したがって、培養培地に可溶性のNotchリガンドの添加は6,7シグナリング通常のノッチを減衰させることができます。それらが適切にリジッド基板5、 図8、 図9に固定されている場合には幸いなことに、Notchリガンドは、NICDの放出を誘導することができます10。リガンドコートした培養基板上に細胞を播種または細胞へのリガンドでコーティングしたビーズを適用し、両方のNotchシグナル伝達を活性化し、それらの間の選択は、Notch刺激の所望のタイミングに主に依存することができます。機能または分化アッセイの中点の間に所望されるように、即時、一時的なNotchシグナル伝達の活性化のために、Notchリガンドは、アガロースビーズに結合させることができ、培養細胞に適用し、任意の時点で洗い流さ。培養期間の開始から、より持続的なNotchシグナル伝達のために、組織培養プレートを細胞播種の前に、リガンドでコーティングすることができます。
このプロトコルの目的のために、方法は、マウス破骨細胞前駆体を用いて行われるが、ここで記載された方法の方法及び変形は、細胞タイプ6、11、12、13の広範囲に適用可能であり、 </SUP> 14。破骨細胞は、骨組織の再吸収に関与している分化した造血LINAGE細胞であり、それらは、骨喪失15の多数の疾患に関与しています。したがって、それらの単球/マクロファージ系統の前駆体とその機能を制御する分子機構からの破骨細胞の分化のin vitroでの研究では、破骨細胞と新しい骨再生治療法の開発をよりよく理解するために不可欠です。それは現在、一般的に、そのNotchシグナル伝達は、破骨細胞の分化および機能に積極的な役割を果たして受け入れられているが、Notchシグナル伝達の刺激および破骨細胞前駆体の培養および分化の両方の変化は、最初は相反する知見16、17、18、19につながりました。クローサー方法の違いの検査や遺伝子の使用モデルが大幅破骨細胞形成におけるNotchシグナル伝達の役割を明らかにしているが、標準化されたノッチ刺激および培養方法の適用は、他の細胞型20、21、22、23におけるNotchシグナル伝達の今後の研究で、このような論争を防ぐことができます。
Notchシグナル伝達を刺激するための様々な方法のように、最善の方法は、実験的な質問に依存し、そこに培養すると、マウスの破骨細胞前駆体を区別するための複数の方法がある、と。ここで、マウスの長骨からフラッシュ骨髄細胞の接着性および非接着性画分を培養する我々の好ましい方法は提示されます。この方法は、本質的に特殊な装置を必要とせず、分化の様々な方法に適用可能である細胞を産生するという利点を有します。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコル内の重要なステップ
文化と破骨細胞前駆体の試験管内分化には、破骨細胞形成と骨再生および骨量の保存のための治療標的の同定の分子機構の調査のための有用なプラットフォームを提供します。マウスの破骨細胞前駆体を培養する場合、最も重要な要素はナイーブ状態の前駆体のメンテナンスです。マクロファージ様細胞として、破骨細胞前駆体は、細…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the University of Pennsylvania Center for Musculoskeletal Disorders (5 P30 AR050950-09), a grant from the AO Foundation (S-16-12A), the Philadelphia VA Medical Center Translational Musculoskeletal Research Center, and an intramural orthopaedic surgery departmental research development fund. JWA is supported by the University of Pennsylvania Postdoctoral Opportunities in Research and Teaching (PENN-PORT) fellowship funded by the National Institute of General Medical Sciences Institutional Research and Career Development Award (IRACDA; 5 K12 GM081259-08).
Materials
| Recombinant mouse M-CSF | Biolegend | 576402 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant mouse RANKL | Shenandoah Biotechnology | 200-04 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant human Jagged1-Fc | R&D Systems | 1277-JG-050 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Protein G agarose beads | InvivoGen | gel-agg-2 | |
| Goat anti-human IgG Fc | Jackson ImmunoResearch | 109-001-008 | |
| Minimum Essential Medium powder | Sigma-Aldrich | M0894 | |
| Accutase cell dissociation reagent | ThermoFisher | A1110501 | Used to lift osteoclast precursors |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | Used to stain differentiated osteoclasts |
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