Stimulering av Notch signale i Muse osteoclast Prekursorer

Summary

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

Abstract

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state.

Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.

This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Introduction

Pattedyr Notch signalveien er homolog med den samme bane i Drosophila melanogaster og består av fire transmembran-Notch-reseptorer (Notch1-4) og fem membranbundne ligander med taggete (JAG1 & JAG2) og Delta-lignende (DLL1, 3, & 4) familier ^1. Hakk signalering blir initiert når Notch-reseptor på en mottagercelle er bundet av ligand på en sender celle ^to. I løpet av denne trans-aktivering, produserer den membranbundne Notch ligand en strekkraft på den membranbundne ^{Notch-reseptor-3, 4.} Strekkraften av ligand binding induserer konformasjonsendringer i Notch-reseptor som muliggjør ekstracellulær spalting av reseptoren ved TNFa konverterende enzym (TACE) etterfulgt av en intracellulær spalting hendelse mediert av et presenilin-inneholdende gamma-secretase kompleks (γ-sekretase). γ-Secretase slipper Notch intracellular domene (NiCd) som translocates inn i kjernen hvor den danner en transkripsjonen aktivering kompleks med CBF-en-Su (H) -Lag-1 (CSL), mastermind-lignende (MAML), og celletypespesifikke faktorer for å drive uttrykk av målgener ^5.

De mekaniske elementer av Notch signale aktivering resulterer i behovet for unike fremgangsmåter for Notch pathway aktivering in vitro. Løselige Notch-ligandene kan binde seg til Notch-reseptorer, men mislykkes i å produsere strekkrefter som er nødvendige for NICD frigivelse, mens på samme tid kompetitivt å inhibere bindingen av celle-assosiert Notch ligander. Således kan tilsetningen av oppløselige Notch ligander til kulturmediet dempe normal Notch signale ^{6, 7.} Heldigvis kan Notch ligander indusere NICD frigivelse hvis de er festet til en passende stivt substrat ^{5, 8, 9,10.} Såing av cellene på ligand-belagte kultur substrater eller påføring av ligand-belagte perler til celler kan aktivere begge hakk signalering, og valget mellom dem avhenger først og fremst av den ønskede tidspunktet for Notch stimulering. For umiddelbar, midlertidig Notch signale aktivering, slik det ville være ønskelig under midtpunktet av en funksjonell eller differensiering assay, Notch ligand kan være bundet til agarosekuler, anvendt på dyrkede celler, og vasket ut til enhver tid. For mer varig hakk signalering fra begynnelsen av en dyrkningsperiode kan vevskulturplater være belagt med ligand før såing celle.

Ved anvendelse av denne protokollen, fremgangsmåter utføres under anvendelse av mus osteoklast forløpere, men de metoder og variasjoner av fremgangsmåtene beskrevet her kan anvendes på et bredt spekter av celletyper ^{6, 11, 12, 13,} </sup> ^14. Osteoklaster er terminalt differensierte blodkreft linage celler som er ansvarlig for resorpsjon av benvev, og de er innblandet i flere forstyrrelser i bentap ^15. Således in vitro-studier av differensieringen av osteoklaster fra sine monocytt / makrofag-avstamning forløpere og de molekylære mekanismer som kontrollerer deres funksjon er viktig for å bedre forståelse av osteoklaster og utvikling av nye ben-regenererende behandling. Mens det er nå generelt akseptert at Notch signalering spiller en positiv rolle ved differensiering og funksjon av osteoklaster, variasjoner i både Notch signale stimulering og osteoclast forløper kultur og differensiering førte til innledningsvis sprikende funn ^{16, 17, 18, 19.} Nærmere undersøkelse av forskjellene i fremgangsmåter og anvendelse av genetiskmodeller har i stor grad avklart rolle hakk signalering i osteoclastogenesis, men anvendelse av standardiserte Notch stimulerings og dyrkningsfremgangsmåter kan forhindre slike strids i fremtidige studier av Notch signalisering i andre celletyper ^{20, 21, 22, 23.}

Det finnes flere metoder for dyrkning og differensiering av mus osteoklast-forløpere, og som med varierende fremgangsmåter for stimulering av Notch-signalering, vil den beste metoden avhenger av eksperimentelle spørsmål. Heri, vil vår foretrukne metode for dyrking heft og ikke-heftende fraksjoner av marg cellene ble jaget fra mus lange bein bli presentert. Denne fremgangsmåten har den fordel at den krever i det vesentlige ingen spesialutstyr og produserende celler som er anvendelig til en rekke differensierings metoder.

Protocol

All forskning som involverer virveldyr ble utført i henhold til protokoller godkjent av University of Pennsylvania Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC). 1. Culture Media Forberedelse Fremstille α-MEM ved oppløsning av minimum essensielt medium (MEM) pulver og 1,9 g natriumbikarbonat i 900 ml H2O og supplere med 2 mM L-glutamin, 100 enheter / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, og 100 ml varme- inaktivert føtalt bovint serum. Steriliser ved hjelp …

Representative Results

Formålet med denne metoden er å kultur og stimulere Notch signalering i osteoklast-forløpere. Når riktig kultivert, osteoklast forløpere viser en hovedsakelig langstrakt spindel-formet morfologi med glatt cytoplasma (figur 1A). Forsiktighet bør utvises for å unngå immunologisk aktivering av osteoklast forløpere. Ved aktivering forløpere spre seg og bli flatet med skummende cytoplasma (figur 1B). Disse "stekt egg" cellene er resistente…

Discussion

Kritiske trinnene i protokollen

Kultur og in vitro differensiering av osteoklast forløpere gir en nyttig plattform for undersøkelse av molekylære mekanismer for osteoclastogenesis og identifisering av terapeutiske mål for bein regenerering og bevaring av benmasse. Når dyrking mus osteoklast forløpere, er den mest kritiske elementet vedlikehold av forløpere i en naiv tilstand. Som makrofaglignende celler, osteoklast forløpere primet for å svare på bakterielle komponenter og pr…

Materials

Recombinant mouse M-CSF	Biolegend	576402	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant mouse RANKL	Shenandoah Biotechnology	200-04	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant human Jagged1-Fc	R&D Systems	1277-JG-050	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Protein G agarose beads	InvivoGen	gel-agg-2
Goat anti-human IgG Fc	Jackson ImmunoResearch	109-001-008
Minimum Essential Medium powder	Sigma-Aldrich	M0894
Accutase cell dissociation reagent	ThermoFisher	A1110501	Used to lift osteoclast precursors
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit	Sigma-Aldrich	387A-1KT	Used to stain differentiated osteoclasts