Stimulering av Notch signalering i mus osteoklastprekursorer

Summary

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

Abstract

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state.

Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.

This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Introduction

Däggdjurs Notch signalväg är homolog med samma väg i Drosophila melanogaster och består av fyra transmembran Notch-receptorer (Notch1-4) och fem membranbundna ligander av den Jagged (JAG1 & JAG2) och Delta-liknande (DLL1, 3, & 4) familjer ^1. Notch-signalering initieras när Notch receptor på en mottagande cell är bunden av ligand på en sändande cell ^2. Under denna trans-aktivering, producerar den membranbundna Notch-ligand en sträckkraft på membranbundna Notch-receptor ^{3, 4.} Sträckningskraften av ligand bindning inducerar konformationsförändringar i den Notch-receptor som underlättar extracellulär klyvning av receptorn genom TNFalpha omvandlande enzym (TACE), följt av en intracellulär klyvning händelse medieras av ett presenilin-innehållande gamma-sekretas-komplexet (γ-sekretas). γ-sekretas frigör Notch intracellular domän (NiCd), som translokerar in i kärnan där den bildar en transkriptionsaktiveringskomplex med CBF-1-Su (H) -Lag-1 (CSL), mastermind-liknande (MAML), och cell typspecifika faktorer för att driva uttryck av målgener ^5.

De mekaniska elementen av Notch-signalering aktivering resulterar i behovet av unika metoder av Notch vägsaktivering in vitro. Lösliga Notch-ligander kan binda till Notch-receptorer, men misslyckas med att producera sträckkrafter som är nödvändiga för NICD frisättning medan på samma gång att kompetetivt hämma bindning av cellassocierade Notch-ligander. Således kan tillsats av lösliga Notch ligander till odlingsmedium dämpa normal Notch-signal ^{6, 7.} Lyckligtvis kan Notch-ligander inducerar NICD frisättning, om de är fixerade till ett lämpligt styvt substrat ^{5, 8, 9,10.} Sådd celler på ligand-belagda odlingssubstrat eller tillämpa ligand-belagda pärlor till celler kan både aktivera Notch-signalering, och valet mellan dem beror främst på den önskade tidpunkten för Notch stimulering. För omedelbar, temporär aktivering Notch-signalering, som man kunde önska under mittpunkten av en funktionell eller differentiering analys Notch-ligand kan bindas till agarospärlor, tillämpas på odlade celler och tvättas ut när som helst. För mer ihållande Notch-signalering från början av en odlingsperiod, kan vävnadsodlingsplattor vara belagda med ligand före cellsådd.

Vid tillämpningen av detta protokoll, metoder genomförs med hjälp av musen osteoklastprekursorer, men de metoder och variationer på de metoder som beskrivs här kan tillämpas på en mängd olika celltyper ^{6, 11, 12, 13,} </sup> ^14. Osteoklaster är terminalt differentierade hematopoetiska Linage celler som är ansvariga för resorptionen av benvävnad, och de är inblandade i flera sjukdomar i benförlust ^15. Således, in vitro-studie av differentieringen av osteoklaster från deras monocyt / makrofag-härstamning prekursorer och de molekylära mekanismer som styr deras funktion är nödvändig för att bättre förståelse av osteoklaster och utveckling av nya ben regenere terapier. Även om det är nu allmänt accepterat att Notch-signalering spelar en positiv roll i differentiering och funktion av osteoklaster, variationer i både Notch-signalering stimulering och osteoklaster föregångare kultur och differentiering ledde till initialt motstridiga slutsatser ^{16, 17, 18, 19.} En närmare granskning av skillnaderna i metoder och användning av genetiskamodeller har kraftigt klar roll Notch signalering i osteoklastogenes, men tillämpning av standardiserade Notch stimulering och odlingsmetoder kan förhindra sådana kontroverser i framtida studier av Notch signalering i andra celltyper ^{20, 21, 22, 23.}

Det finns flera metoder för odling och differentiering av mus osteoklastprekursorer, och som med varierande förfaranden för stimulering av Notch-signalering, kommer den bästa metoden att bero på den experimentella fråga. Häri, kommer vårt föredragna förfarande för odling av vidhäftande och icke-vidhäftande fraktioner av märgceller spolas från mus långa ben att presenteras. Denna metod har den fördelen att kräva i huvudsak ingen specialutrustning och att producera celler som kan tillämpas på en mängd olika differentieringsmetoder.

Protocol

All forskning ryggradsdjur genomfördes i enlighet med protokoll som godkänts av University of Pennsylvania Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC). 1. Kultur Media Preparation Förbereda α-MEM genom upplösning av minimalt essentiellt medium (MEM) pulver och 1,9 g natriumbikarbonat i 900 ml H2O och komplettera med 2 mM L-glutamin, 100 enheter / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin och 100 ml värme- inaktiverat fetalt bovint serum. Sterilise…

Representative Results

Syftet med denna metod är att kultur och stimulera Notch signalering i osteoklastprekursorer. Vid korrekt odlade, osteoklastprekursorer uppvisar en i huvudsak långsträckt spolformad morfologi med mjuk cytoplasman (Figur 1A). Försiktighet bör vidtas för att undvika immunologisk aktivering av osteoklastprekursorer. Vid aktivering, prekursorer spridas och bli tillplattade med skummande cytoplasman (Figur 1B). Dessa "stekt ägg" celler är re…

Discussion

Kritiska steg i protokollet

Kultur och in vitro differentiering av osteoklastprekursorer ger en användbar plattform för utredning av molekylära mekanismer av osteoklastogenes och identifiering av terapeutiska mål för benuppbyggnad och bevarande av benmassa. När odling mus osteoklastprekursorer, är den mest kritiska delen underhåll av prekursorer i en naiv tillstånd. Såsom makrofag-liknande celler, är osteoklastprekursorer trimmade för att svara på bakteriella komponenter o…

Materials

Recombinant mouse M-CSF	Biolegend	576402	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant mouse RANKL	Shenandoah Biotechnology	200-04	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant human Jagged1-Fc	R&D Systems	1277-JG-050	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Protein G agarose beads	InvivoGen	gel-agg-2
Goat anti-human IgG Fc	Jackson ImmunoResearch	109-001-008
Minimum Essential Medium powder	Sigma-Aldrich	M0894
Accutase cell dissociation reagent	ThermoFisher	A1110501	Used to lift osteoclast precursors
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit	Sigma-Aldrich	387A-1KT	Used to stain differentiated osteoclasts