Mit Zebrabärbling Modelle menschlicher Influenza-A-Virus-Infektionen Virostatika auf Bildschirm und Host-Immun-Zell-Antworten Charakterisieren

Summary

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

Abstract

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Introduction

Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO), infizieren Influenzaviren 5-10% der Erwachsenen und 20-30% der Kinder jährlich und verursachen 3,5 Millionen Fälle von schwerer Krankheit und bis zu 500.000 Todesfälle weltweit ^1. Jährliche Impfungen gegen Influenza bleiben die beste Option, Krankheit zu verhindern. Die Bemühungen wie der WHO Global Action Plan haben saisonale Impfstoff Gebrauch Impfstoff Produktionskapazität erhöht und die Forschung und Entwicklung wirksamer Impfstoff Strategien, um die Morbidität und Mortalität im Zusammenhang mit saisonalen Influenza – Ausbrüche ² zu reduzieren. Antivirale Medikamente wie Neuraminidase – Inhibitoren (zB Zanamivir und Oseltamivir) sind in einigen Ländern verfügbar und haben bei der Milderung Symptome wirksam erwiesen, wenn ³ innerhalb der ersten 48 Stunden nach Auftreten ^{verabreicht, 4, 5.} Trotz weltweiten Bemühungen, Eindämmung der saisonalen Grippe outbreaks bleibt eine große Herausforderung zu diesem Zeitpunkt, wie Influenzavirus Antigendrift oft Strom Fähigkeiten überschreitet ⁶ an den sich ändernden Genom des Virus anzupassen. Impfstrategien neue Stämme des Virus Targeting muss im Voraus entwickelt werden und sind manchmal weniger gemacht als optimal wirksam durch unvorhergesehene Änderungen in der Art der Stämme, die schließlich in einer Influenza-Saison überwiegen. Aus diesen Gründen ist ein eindeutiger Bedarf für die Aufnahme Infektionen alternative therapeutische Strategien zu entwickeln, und die Verringerung der Mortalität. Durch Erreichen Interaktion ein besseres Verständnis der Wirt-Virus kann es möglich sein , neue anti-Influenza – Medikamente zu entwickeln und adjuvante Therapien ^{7, 8.}

Der menschliche Wirt-Influenza-A-Virus (IAV) Interaktion ist komplex. Mehrere Tiermodelle menschlicher IAV-Infektion haben, um einen Einblick in die Wirt-Virus-Interaktion, includ entwickelting Mäuse, Meerschweinchen, Baumwolle Ratten, Hamster, Frettchen und Makaken ^9. Während wichtige Daten bietet, die das Verständnis der Wirt-IAV Dynamik verbessert haben, besitzt jedes Modellorganismus erhebliche Nachteile, die berücksichtigt werden müssen, wenn die Ergebnisse in der Humanmedizin zu übersetzen versucht. Zum Beispiel Mäuse, die die am weitesten verbreitete Modell sind, entwickeln sich nicht leicht-IAV induzierte Symptome der Infektion , wenn sie mit menschlichen Influenza – Isolaten ⁹ infiziert. Dies liegt daran , Mäuse die natürliche Tropismus für Influenza beim Menschen fehlt isoliert da Zellen Maus epithelialen α-2,3 Sialinsäure – Bindungen exprimieren , anstelle der α-2,6 Sialinsäure – Bindungen , bezogen auf die menschlichen Epithelzellen ^10. Die Hämagglutinin – Proteine in menschlichen IAV – Isolate positiv binden und Wirtszellen tragen α-2,6 Sialinsäure – Bindungen durch rezeptorvermittelte Endozytose ^{9, 11,} geben Sie </sbis> ^{12, 13.} Als Folge wird nun angenommen, dass Mausmodelle für menschliche Influenza bei der Entwicklung darauf geachtet werden, muss die entsprechende Belastung der Maus mit dem entsprechenden Influenza-Stamm, um zu paaren Krankheitsphänotypen zu erreichen, die Aspekte der menschlichen Krankheit rekapitulieren. Im Gegensatz dazu besitzen Epithelzellen in den oberen Atemwegen von Frettchen α-2,6 – Bindungen , die Sialinsäure menschlichen Zellen ¹⁴ ähneln. Infizierte Frettchen teilen viele der pathologischen und klinischen Merkmale bei der menschlichen Krankheit beobachtet, darunter die Pathogenität und Übertragbarkeit von Mensch und Vogelgrippeviren ^{14, 15.} Sie sind auch auf die Wirksamkeit des Impfstoffes Studien sehr zugänglich. Dennoch hat das Frettchen Modell für die menschliche Influenza hauptsächlich einige Nachteile in Bezug auf ihre Größe und die Kosten der Haltung, die Akquisition von statistisch signifi machenkippe Daten herausfordernd. Darüber hinaus haben Frettchen angezeigt zuvor Unterschiede in der Arzneimittel Pharmakokinetik, Bioverfügbarkeit und Toxizität, die Prüfung der Wirksamkeit erschweren. Zum Beispiel Frettchen Toxizität für den M2 – Ionenkanal – Inhibitor Amantadin ¹⁶ aufweisen. Somit ist es klar, dass ein Tiermodell bei der Wahl Fragen über die menschliche IAV-Infektionen zu untersuchen, ist es wichtig, die besonderen Vorteile und Einschränkungen zu berücksichtigen, und den Aspekt des Wirt-Virus-Interaktion, die untersucht wird.

Der Zebrabärbling, Danio rerio, ist ein Tiermodell , das für die Untersuchung von mikrobiellen Infektion einzigartige Möglichkeiten bietet, Immunantwort Host und potentielle Arzneimitteltherapien ^{17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,} <sup class = "xref"> ^{24, 25, 26, 27, 28.} Die Anwesenheit von α-2,6-verknüpften Sialinsäuren an der Oberfläche von Zellen in der Zebrabärbling vorgeschlagen seine Anfälligkeit für IAV, die ¹⁹ wurde in Infektionsstudien und abgebildet in vivo unter Verwendung eines Fluoreszenz – Reporter – Stamm von IAV bestätigt. In IAV-infizierten Zebrabärbling erhöhte Expression der antiviralen ifnphi1 und mxa Transkripte zeigten , dass eine angeborene Immunantwort stimuliert worden waren, und die von der IAV-infizierten Zebrabärbling angezeigt Pathologie, einschließlich Ödemen und Gewebezerstörung, war ähnlich wie in der menschlichen Influenza – Infektionen beobachtet . Darüber hinaus ¹⁹ der IAV antivirale Neuraminidasehemmer Zanamivir begrenzte Mortalität und reduziert die Virusreplikation in Zebrabärbling.

In diesem Bericht wird ein Protokoll für die System initiiertic IAV-Infektionen in Zebrafischembryonen beschrieben. Mit Zanamivir bei klinisch relevanten Dosen als Proof-of-Prinzip, die Nützlichkeit dieses Zebrabärbling Modell IAV-Infektion für Screening von Verbindungen auf antivirale Aktivität nachgewiesen wird. Darüber hinaus ist eine lokalisierte epitheliale IAV – Infektion in der Zebrabärbling Blase schwimmen ein Protokoll für die Erzeugung, ein Organ , das anatomisch zu betrachten ist und funktionell analog zu der Säugerlungen ^{21, 29, 30, 31,} beschrieben. Mit dieser lokalisierten IAV-Infektionsmodell kann neutrophilen Rekrutierung an den Ort der Infektion verfolgt werden, so dass Untersuchungen über die Rolle der neutrophilen Biologie in der IAV-Infektion und Entzündung. Diese Modelle Zebrabärbling Ergänzung bestehender Tiermodellen von menschlichen IAV-Infektionen und sind besonders nützlich zum Testen von kleinen Molekülen und Immunzellantworten aufgrund der Möglichkeit einer verstärkten sTATISTISCHE Leistung, Kapazität für moderate- zu Assays mit hohem Durchsatz und die Fähigkeiten, um Immunzellverhalten und die Funktion mit Lichtmikroskopie verfolgen.

Protocol

Alle Arbeiten sollten von den US Centers for Disease Control (CDC) und gemäß den Richtlinien festgelegt durch Institutional Animal Care und Verwenden Komitees (IACUC) beschrieben unter Verwendung von Biosicherheitsstufe 2 (oder BSL2) Standards durchgeführt werden. Bitte Rücksprache mit den zuständigen Beamten Sicherheit und die Einhaltung zu gewährleisten. 1. Zebrabärbling Pflege und Wartung Spawn Zebrabärbling und sammeln die erforderliche Anzahl von Embryonen für die Ex…

Representative Results

Hier werden Daten zeigen , wie die systemische Infektion IAV in Zebrabärbling verwendet werden kann , um die Arzneimittelwirksamkeit (1A) -Test vorgesehen sind. Embry bei 48 Stunden nach der Befruchtung sind mit APR8 (1C, 1F), X-31 (Figuren 1D, 1G) oder NS1-GFP (Abbildungen 1 H-1I) über den Kanal von Cuvier injiziert , um eine virale Infektion zu initiieren. Eine weitere Gruppe von Embryonen bei 48 Stunden nach der Bef…

Discussion

Um die Vorteile gewonnen aus mit einem kleinen Tier maximieren menschlichen Wirt-Pathogen-Interaktionen zu modellieren, ist es wichtig, Forschungsfragen und Testen von Hypothesen zu formulieren, dass auf die inhärenten Vorteile des Modellsystems zu nutzen. Als Modell für die menschliche IAV-Infektion hat der Zebrabärbling mehrere Stärken, einschließlich hoher Fruchtbarkeit, optische Klarheit, Zugänglichkeit für Wirkstoff-Screening, und die Verfügbarkeit von transgenen Linien, die Immunzellen wie Neutrophilen bes…

Materials

Instant Ocean	Spectrum Brands	SS15-10
100 x 25 mm sterile disposable Petri dishes	VWR	89107-632
Transfer pipettes	Fisherbrand	13-711-7M
Tricaine- S (MS-222)	Western Chemical
Borosilicate glass capillary with filament	Sutter Instrument	BF120-69-10
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Agarose	Lonza	50004
Zanamivir	AK Scientific	G939
Dumont #5 forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-D
Microloader tips	Eppendorf	930001007
Microscope immersion oil	Olympus	IMMOIL-F30CC
Microscope stage calibration slide	AmScope	MR095
MPPI-3 pressure injector	Applied Scientific Instrumentation
Stereo microscope	Olympus	SZ61
Back pressure unit	Applied Scientific Instrumentation	BPU
Micropipette holder kit	Applied Scientific Instrumentation	MPIP
Foot switch	Applied Scientific Instrumentation	FSW
Micromanipulator	Applied Scientific Instrumentation	MM33
Magnetic base	Applied Scientific Instrumentation	Magnetic Base
Phenol red	Sigma-Aldrich	P-4758
Low temperature incubator	VWR	2020
SteREO Discovery.V12	Zeiss
Illuminator	Zeiss	HXP 200C
Cold light source	Zeiss	CL6000 LED
Glass-bottom multiwell plate, 24 well	Mattek	P24G-0-13-F
Confocal microscope	Olympus	IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
Fluoview software	Olympus
Prism v6	GraphPad
Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus	Charles River	490710
Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2)	Charles River	490715
Influenza NS1-GFP			Referenced in Manicassamy et al. 2010
Tg(mpx:mCherry)			Referenced in Lam et al. 2013