이 원고는 형태 학적 및 생화학 적으로 말의 난 모세포를 특성화하기위한 실험적 접근법을 기술한다. 특히, 본 연구는 초음파 유도 난자 채취 (OPU)에 의한 미성숙 및 성숙한 난 모세포를 수집하는 방법과 염색체 분리, 스핀들 형태, 전 세계 히스톤 아세틸 화 및 mRNA 발현을 조사하는 방법을 설명한다.
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이 논문에서
요약
초록
보조 생식 분야는 여성, 동반자 동물 및 멸종 위기 종의 불임 치료를 위해 개발되었습니다. 말의 보조 생식은 또한 스포츠 경력을 방해하지 않고 높은 수행자의 배아 생산을 허용하고 높은 유전 적 가치의 암말로부터 도태 한 새끼 수의 증가에 기여합니다. 본 원고는 난자 채취 (OPU)를 이용하여 말의 난소에서 미성숙 및 성숙 난 모세포를 채취하는 과정을 설명한다. 이 난 모세포는 마우스에서 이전에 개발 된 프로토콜을 적용하여 이수 배수 체의 발병률을 조사하는데 사용되었다. 특히, 중기 II 세포 (MII) 난 모세포의 염색체와 중심체 (centromeres)는 공 촛점 레이저 현미경 검사 후 순차적 초점 계획에서 형광으로 분류되고 계수되었다. 이 분석은 미성숙 난 모세포가 난포에서 채취 되고 생체 외에서 성숙되었을 때 이수 배수체 비율에서 더 높은 발병률을 나타냈다.생체 내. 특정 라이신 잔기에서 튜 불린 및 히스톤 4의 아세틸 화 형태에 대한 면역 염색 또한 감수 분열의 형태 및 히스톤 아세틸 화의 전체 패턴에서의 차이를 나타냈다. 마지막으로, 역전사 및 정량적 PCR (q-PCR)에 의해 히스톤 탈 아세틸 화 효소 (HDAC) 및 아세틸 트랜스퍼 라제 (HAT)를 코딩하는 mRNA의 발현을 조사 하였다. 시험 관내 및 생체 내에서 성숙한 난 모세포 사이 에서 전사 물의 상대적인 발현에 차이는 관찰되지 않았다. oocyte 성숙 동안 전사 활동의 일반적인 침묵과 일치하여 총 전사 양의 분석은 mRNA 안정성 또는 분해를 나타낼 수 있습니다. 따라서 이러한 결과는 다른 번역 및 번역 후 규정이 영향을받을 수 있음을 나타냅니다.
전반적으로,이 연구는 형태학 및 생화학 적으로 말의 난 모세포, cell 유형은 낮은 샘플 가용성으로 인해 연구하기 매우 어렵습니다. 그러나, 그것은 생식 생물학 및 monovulatory 종족에 불임에 대한 우리의 지식을 확장 할 수 있습니다.
서론
여성, 동반자 동물 및 멸종 위기에 처한 종의 불임 치료를 위해 광범위한 재현 기술이 개발되었습니다. 임상 환경에서 가장 보편적 인 절차 중 하나는 초음파 유도 질식 흡입, 난자 채집 (OPU) 1 에 의한 난소에서 난태 (metaphase) II (MII) 단계 난 모세포를 회수하는 것입니다. 이 난 모세포는 수용체 자궁에 이식 된 배아와 함께 시험 관내 (IVF)에서 수정된다. MII- 단계 (성숙한) 난 모세포는 외인성 생식선 자극 호르몬의 투여 후에 회수된다. 그러나이 치료법은 일부 환자에서 난소과 자극 증후군 (OHSS) 2 의 발병과 관련이 있습니다.
한 번 모낭에서 분리 된 자발적으로 감수 분열을 재개하기위한 완전히 성장한 미숙 난 모세포 (GV-stage)의 내재적 인 능력을 이용하여, 관리자없이 성숙한 난 모체를 얻을 수 있습니다gonadotropin 조율 3 . 이 과정은 난자 시험관 내 성숙 (IVM)이라고 불리우며 생식 기술을 돕는 데있어 덜 약물 지향적이고 덜 비싸며 환자 친화적 인 접근 방식을 의미합니다. 그러나 체외 에서 ....
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프로토콜
모든 절차는 동물 보호 및 사용위원회 CEEA Val de Loire Number 19에 의해 승인되었으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 난 모세포 수집 및 생체 외 성숙
- 오옴 픽업
- 매일 성인 암말 집단에서 난소 난소의 직경을 초음파로 평가합니다. 난포가 33 mm 이상일 때, 정맥 정맥 상부에 1,500 IU의 인간 chorionic gonadotrophin (hCG)을 주입한다 (iv).
- 주사를하기 전에 알코올로 부위를 닦고 경정맥을 찾은 다음 주사 부위 아래에 2 ~ 3cm 정도의 엄지 손가락을 대어 정맥이 올라 오도록하십시오. 바늘을 목에 거의 평행하게 삽입하고 바늘이 정맥에 있는지 확인하십시오 (혈액이 주사기로 들어갑니다). 이 시점에서 주사; hCG는우성 여포에있는 난 모세포의 발달.
- hCG 주사 35 시간 후 detomidine (15 μg / kg, iv), butorphanol tartrate (10 μg / kg, iv) 및 butylscopolamine bromure (0.2-0.3 mg / kg, 15 mL / mare, iv)로 수컷을 진정시킨다....
- 매일 성인 암말 집단에서 난소 난소의 직경을 초음파로 평가합니다. 난포가 33 mm 이상일 때, 정맥 정맥 상부에 1,500 IU의 인간 chorionic gonadotrophin (hCG)을 주입한다 (iv).
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결과
이 실험에 대한 최초의 발견은 앞서 깊이있게 설명되었으며 본원에서 기술 된 프로토콜을 사용하여 얻을 수있는 결과의 예로서보고되었다.
성숙 비율
지배 모낭으로부터 OPU에 의해 회수 된 32 개의 COC 중 28 개 (88 %)가 MII 단계에 있었다. 크기가 5-25mm 인 모낭으로부터 수집 된 58 개의 COC 중 14 개는 mRNA 발현 연구를 위해 미성숙 난자로 즉각적으로 동결되었다. 나머지 44 명은 시험 관내에서 성숙되었고, 37 명은 MII 단계 (85 %)에 도달했다. 성숙 효율은 두 군에서 유의 한 차이가 없었다 (Fisher 's exact test P> 0.05).
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토론
비록 IVM이 20 년 이상 말에서 수행되었지만, 우리는 인간에게 제안 된 것처럼 난 모세포가 배아 이수 배체의 기원이 될 수 있는지 여부를 아직 모른다. 그 이유는 염색체 계수를위한 난 모세포의 준비가 상당한 표본 손실을 초래할 수 있기 때문일 것입니다. 이를 염두에두고 염색체 분리의 오류를 조사하는 데 사용 된 방법을 조사하여 말의 난 모세포에 적용 할 수있는 가장 적합한 기술을 찾아 냈습니다. 과학 문헌에서 네 가지 주요 기술이 발견되었습니다 : 1) 염색체 확산 5 , 18 , 19 , 2) 형광 in situ hybridization (FISH) 4 , 6 , 17
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
저자들은 레이저 스캐닝 공 촛점 현미경 (LSCM) , Philippe Barrière 및 Thierry Blard의 매일 초음파 난소 스캐닝 및 hCG 주입에 대한 지원을 위해 Fabrice Vincent에게 감사드립니다. 이 작품은 부분적으로 "Regione Sardegna and Regione Lombardia"프로젝트 "Ex Ovo Omnia"(보조금 26096200에서 AML로)에 의해 지원되었습니다. "L' Oreal Italia per le Donne e la Scienza 2012"Fellowship (2012 년 FF로 계약), FP7-PEOPLE-2011-CIG, 연구 집행 기관 (REA) "Pro-Ovum"(부여 번호 303640 - VL); 유럽 사회 기금, 인적 자원 개발 부문 별 운영 프로그램 (2007-2013 년 계약 번호 : POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371 in IM)이 공동으로 후원하는 농업 및 수의학 박사 과정이있다. in vivo oocyte collection은 Français du Cheval et de l' Equitation에 의해 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 초음파 프로브 | Aloka | UST-5820-7,5 | |
| 인간 융모성 성선 자극 호르몬 | 중심 | CHO004 | 1,500 단위/동물 IV |
| 데토미딘 | 중심 | MED010 | 9 - 15 &마이크로; g/kg IV |
| 부틸스코폴라민 브로무어 | 센트라벳 | EST001 | 0.2 mg/kg IV |
| 실체현미경 | NIKON SMZ-2B | ||
| 부토르파놀 | 센트라벳 | DOL003 | 10µ g/kg IV |
| 벤질-페니실린 | 센트라벳 | DEP203 IM | 15,000 UI/동물 |
| TCM199 | 시그마-알드리치 | M3769 10X1L | 분말 헤페스 완충 TCM199 |
| 헤페스 나트륨염 | 시그마-알드리치 | H3784-100G | |
| 소 혈청 알부민 | 시그마-알드리치 | A8806 | |
| 헤파린 | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| NaHCO3-buffered TCM199 | IVM 중간 | Sigma-Aldrich | M2154-500ML |
| Sigma-Aldrich | E4127 | ||
| 신생아 송아지 혈청 | Sigma-Aldrich | N4762-500ML | |
| 4웰 접시 | NUNCLON | 144444 | |
| 인큐베이터 | 헤레우스 | BB6060 | |
| 모나스트롤 | , 시그마-알드리치 | M8515 | |
| 히알루로니다아제 | , 시그마-알드리치 | H3506 | |
| 프로나제 | , 시그마-알드리치, | P5147 | |
| 파라포름알데히드 | , 시그마-알드리치 | P6148 | |
| 폴리비닐 알코올 | 시그마-알드리치 | 341584 | |
| 트리톤-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| 일반 당나귀 혈청 | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 토끼 안티 오로라 B phospho-Thr232 | BioLegend | 636102 | |
| TRITC 결합 당나귀 안티 토끼 IgG | Vector Laboratories | 711-025-152 | |
| Vecta-Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| YOPRO1 | 써모피셔 과학 | Y3603 | |
| 컨 포칼 레이저 스캐닝 현미경 | LSM 780 | 자이스 | |
| 컨 포칼 레이저 스캐닝 현미경 | LSM 700 | 자이스 | |
| ImageJ 소프트웨어 | rsb.info. nih.gov/ij/download.html | 무료 리소스 | |
| 마우스 안티 알파 튜불린 | 시그마 - 알드리치 | T8203 | |
| 토끼 안티 acH4K16 | 업스테이트 생명 공학 | 07-329 | |
| AlexaFluor 488-coniugated 당나귀 안티 마우스 IgG | Life Technologies | A21202 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Sigma-Aldrich | D8417 | DAPI |
| 원심분리기 | Eppendorf | 5417R | |
| RNALater | Invitrogen | AM7020 | |
| Luciferase RNA | Promega | L4561 | |
| PicoPure RNA 분리 키트 | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| 무작위 헥사머 | Thermofisher Scientific | N8080127 | |
| 마우스 몰로니 백혈병 바이러스 역전사 효소 | Thermofisher Scientific | 28025013 | |
| SYBR 그린 슈퍼믹스 | BioRad | 1708880 | |
| 특이적 프라이머 | Sigma-Aldrich | 특정 프라이머는 Primer3Plus 소프트웨어(무료 리소스)를 사용하여 설계되었으며, | |
| thermal-cycler | BioRad | MyiQ | |
| 마우스 단클론 항CENPA Abcam | ab13939 | ||
| 마우스 단클론 항 Aurora B | Abcam | ab3609 |
참고문헌
- Dellenbach, P. Transvaginal, sonographically controlled ovarian follicle puncture for egg retrieval. Lancet. 1 (8392), 1467(1984).
- Humaidan, P. Ovarian hyperstimulation syndrome: review and new classification criteria for reporting....
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