Kortlægning af RNA-RNA-interaktioner globalt ved anvendelse af biotinyleret psoralen

Summary

Her beskriver vi metoden for S- ækvurdering af P soralen tværbundet, L igateret og S valgte H ybrids (SPLASH), som muliggør genomgående kortlægning af intramolekylære og intermolekylære RNA-RNA-interaktioner in vivo . SPLASH kan anvendes til at studere RNA-interaktomer af organismer, herunder gær, bakterier og mennesker.

Abstract

At vide, hvordan RNA'er interagerer med sig selv og med andre er nøglen til at forstå RNA-baseret genregulering i cellen. Mens eksempler på RNA-RNA-interaktioner, såsom mikroRNA-mRNA-interaktioner, har vist sig at regulere genekspression, er det fulde omfang, som RNA-interaktioner forekommer i cellen endnu ikke kendt. Tidligere metoder til undersøgelse af RNA-interaktioner har primært fokuseret på delsæt af RNA'er, der interagerer med et bestemt protein eller RNA-species. Her beskriver vi en metode, der hedder S- ækvurdering af P soralen tværbundet, L igated, og S valgte H ybrids (SPLASH), der tillader genomsøgning af RNA-interaktioner in vivo på en upartisk måde. SPLASH udnytter in vivo tværbinding, nærhedsligation og høj gennemstrømningssekvensering for at identificere intramolekylære og intermolekylære RNA baseparingspartnere globalt. SPLASH kan anvendes til forskellige organismer, herunder bakterier, gær og humane celler, samt aS forskellige cellulære betingelser for at lette forståelsen af ​​dynamikken i RNA organisationen under forskellige cellulære sammenhænge. Hele den eksperimentelle SPLASH-protokol tager cirka 5 dage at fuldføre, og den beregningsmæssige arbejdsgang tager cirka 7 dage at fuldføre.

Introduction

At studere, hvordan makromolekyler foldes og interagerer med hinanden er nøglen til at forstå genregulering i cellen. Medens en stor indsats har været fokuseret i det sidste årti om forståelse af, hvordan DNA og proteiner bidrager til genregulering, er relativt mindre kendt om post-transkriptionel regulering af genekspression. RNA bærer information i både sin lineære rækkefølge og i dens sekundære og tertiære struktur ¹ . Dens evne til at basere par med sig selv og med andre er vigtigt for dets funktion in vivo . Nylige fremskridt i RNA sekundære strukturundersøgelser med høj gennemstrømning har givet værdifulde indblik i placeringen af ​​dobbelt- og enkeltstrengede regioner i transkriptomet ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8} , howeVer information om parring samspillet partnere mangler stadig stort set. For at bestemme hvilken RNA-sekvens der interagerer med en anden RNA-region i transkriptomet, har vi brug for globale parvisoplysninger.

Kortlægning af parvise RNA-interaktioner på global, upartisk måde har traditionelt været en stor udfordring. Mens tidligere fremgangsmåder, såsom CLASH ⁹ , hiCLIP ¹⁰ og RAP ¹¹ , anvendes til at identificere RNA-interaktioner på stor skala, kartlægger disse teknikker typisk RNA-baseparring for en delmængde af RNA'er, der enten interagerer med et bestemt protein eller RNA-species. Den seneste udvikling i undersøgelsen af ​​globale RNA-interaktioner indbefatter metoden RPL ¹² , som ikke stabiliserer RNA-interaktioner in vivo og derfor kun kan opfange en delmængde af in vivo interaktioner. For at overvinde disse udfordringer udviklede vi og andre genomgående, upartiske strategier til maP RNA-interaktomer in vivo ved anvendelse af modificerede versioner af tværbindingspsoralen ^{13 , 14 , 15} . I denne protokol beskriver vi detaljerne for udførelse af S- ækvurdering af P- sorbundet tværbundet, L igated og S valgte H ybrids (SPLASH), der anvender biotinyleret psoralen til tværbindingsbaseparations-RNA'er in vivo efterfulgt af nærhedsligation og høj gennemstrømningssekvensering til Identificere RNA baseparingspartnere genom-bred ( figur 1 ) ¹⁵ .

I dette manuskript beskriver vi trinene til udførelse af SPLASH ved hjælp af dyrkede adhærente celler, i dette tilfælde HeLa-celler. Den samme protokol kan let tilpasses til suspensionspattedyrceller og til gær- og bakterieceller. Kort sagt behandles HeLa-celler med biotinyleret psoralen og bestråles ved 365 nm for at krydsbinde interaktive RNA basepar in vivo.. RNA'erne ekstraheres derefter fra cellerne, fragmenteret og beriget for tværbindingsregioner under anvendelse af streptavidinperler. Interagerende RNA-fragmenter ligeres derefter sammen ved anvendelse af nærhedsligation og fremstilles i et cDNA-bibliotek til dyb sekventering. Efter sekventering kortlægges de kimære RNA'er på transcriptomet / genomet for at identificere de RNA-interagerende regioner, som er parret til hinanden. Vi har med succes udnyttet SPLASH til at identificere tusindvis af RNA-interaktioner in vivo i gær og forskellige humane celler, herunder intramolekylær og intermolekylær RNA-baseparring i forskellige klasser af RNA'er, såsom snoRNA'er, lncRNA'er og mRNA'er, for at se på strukturelle organisations- og interaktionsmønstre Af RNA'er i cellen.

Protocol

1. Behandling af HeLa-celler med biotinyleret psoralen og RNA-ekstraktion Culture HeLa celler i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin streptomycin (PS) i en 10 cm plade. Vask HeLa-cellerne to gange med 5 ml 1x PBS. Tøm overskydende PBS helt ud af fadet ved at placere fadet lodret i 1 min. Tilsæt 1 ml PBS indeholdende 200 μM biotinyleret psoralen og 0,01% vægt / volumen digitonin, til cellerne ensartet og inkuber ved 37 …

Representative Results

Figur 1 viser skematisk af SPLASH-arbejdsgangen. Ved tilsætning af biotinyleret psoralen i nærvær af 0,01% digitonin og UV-tværbinding ekstraheres totalt RNA fra cellerne, og en dot blot udføres for at sikre, at tværbinding af biotinyleret til RNA'et er sket effektivt ( figur 2 ). Vi bruger biotinylerede 20 base oligos som positive kontroller til titrering af mængden af ​​biotinyleret psoralen, der skal tilsættes…

Discussion

Her beskriver vi i detaljer den eksperimentelle og beregningsmæssige arbejdsgang for SPLASH, en metode, der giver os mulighed for at identificere parvise RNA-interaktioner på en genomgående måde. Vi har med succes udnyttet SPLASH i bakterielle, gær- og menneskelige kulturer og forudser, at strategien kan anvendes bredt til forskellige organismer under forskellige cellulære tilstande. Et af de kritiske trin i protokollen er at starte med mindst 20 μg tværbundet RNA for at have tilstrækkeligt materiale til nedstr…

Materials

1 Kb Plus DNA Ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10787026	DNA ladder
10 bp DNA ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10821-015	DNA ladder
20 % SDS solution	First BASE	BUF-2052-1L
20x SSC	First BASE	BUF-3050-20X1L
3.0 M Sodium Acetate Solution	First BASE	BUF-1151-1L-pH5.2	Required for nucleic acid precipitation
40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1	Bio-Rad	1610145	TBE Urea gel component
Ambion Buffer Kit	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM9010
Ammonium Persulfate, Molecular Grade	Promega	V3131	TBE Urea gel component
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
Chloroform	Merck	1.02445.1000	RNA extraction
Single strand DNA ligase	Epicentre	CL9025K	CircLigase II ssDNA Ligase
Centrifuge tube filters	Sigma-Aldrich	CLS8160-96EA	Costar Spin-X centrifuge tube filters
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE	Sigma-Aldrich	D5628-1G	For cell treatment
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	Dark Reader DR89X Transilluminator	Blue light transilluminator
DNA Gel Loading Dye (6X)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	R0611	Required for agarose gel electroporation
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Pan BioTech	P04-03500	For Hela cell culture
Streptavidin magnetic beads	Life Technologies Holdings Pte Ltd	65002	Dynabeads MyOne Streptavidin C1
Magnetic stand for 15ml tubes	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12301D	DynaMag-15
Magnetic stand for 15ml tubes	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12321D	DynaMag-2
ThermoMixer	Eppendorf	5382 000.015	Eppendorf ThermoMixer C
Biotinylated psoralen	Life Technologies Holdings Pte Ltd	29986	EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin
F8T5/BL	Hitachi	F8T5/BL	365 nm UV bulb
Fetal Bovine Serum	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10270106	Components of Hela medium
Formamide	Promega	H5052	Component in hybridization buffer
G8T5	Sankyo-Denki	G8T5	254 nm UV bulb
Glycogen	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10814010	Required for nucleic acid precipitation
Nanodrop	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Nanodrop 2000	Spectrophotometer for nucleic acidquantification
Nuclease free water	First BASE	BUF-1180-500ml
Penicillin Streptomycin	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15140122	Components of Hela medium
High-Fidelity DNA polymerase (2x)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	F531L	Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x)
Primers Set 1	New England Biolabs	E7335L	PCR primers
DNA Gel Extraction Kit	QIAgen	28106	QIAquick Gel Extraction Kit
Fluorometric Quantification kit	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Q32854	Qubit dsDNA HS Assay Kit
RNA clean up kit	Qiagen	74106	RNeasy Mini Kit Silica-membrane column
Rnase Inhibitor	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM2696	SUPERase In
Reverse transcriptase	Life Technologies Holdings Pte Ltd	18080400	SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix
Nucleic Acid Gel Stain	Life Technologies Holdings Pte Ltd	S11494	SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs	M0201L	End repair enzyme
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L	Enzyme for proximity ligation
T4 RNA Ligase 2, truncated KQ	New England Biolabs	M0373L	Enzyme for adaptor ligation
Temed	Bio-Rad	1610801	TBE Urea gel component
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15596018	TRIzol® Reagent for RNA extraction
Urea	First BASE	BIO-2070-5kg
UV crosslinker	Stratagene	400072	UV Stratalinker 1800
UV Transilluminator	UVP	95-0417-01	For visualizing of bands
Xylene Cyanol FF	Sigma-Aldrich	X4126-10G
DNA cleanup it	Zymo Research	D4004	Zymo DNA concentrator-5
List of software required
FastQC software	0.11.4	http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
SeqPrep software	1.0.7	https://github.com/jstjohn/SeqPrep
BWA software	0.7.12	http://bio-bwa.sourceforge.net/
SAMTOOLS software	1.2.1	http://www.htslib.org/
PULLSEQ software	1.0.2	https://github.com/bcthomas/pullseq
STAR software	2.5.0c	https://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py PYTHON script	PYTHON 2.7.11	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py PYTHON script	PYTHON 2.7.11	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
pickJunctionReads.awk AWK script	AWK GNU 4.1.2	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
Buffer composition
Elution buffer:
0.3 M sodium acetate
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer
100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 7.0
1 mM EDTA
0.5% SDS
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4 °C)
Always add Superase-in fresh before use
2x SSC Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
2X RNA fragmentation buffer
18mM MgCl2
450mM KCl
300mM Tris-CL pH 8.3
2x RNA loading Dye:
95% Formamide
0.02% SDS
0.02% bromophenol blue
0.01% Xylene Cyanol
1mM EDTA
3' RNA adapter sequence	5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC
RT primer sequence	AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG