Cartographie des interactions ARN-ARN à l'échelle mondiale à l'aide de psoralène biotinylé

Summary

Ici, nous détaillons la méthode de l'équation de S de P soralen réticulé, L igated et S élués (SPLASH), ce qui permet une cartographie génomique des interactions intra-moléculaires et intermoleculaires d'ARN-ARN in vivo . SPLASH peut être appliqué pour étudier les interactions de l'ARN des organismes, y compris la levure, les bactéries et les humains.

Abstract

Savoir comment les ARN interagissent avec eux-mêmes et avec d'autres sont essentiels à la compréhension de la régulation des gènes basée sur l'ARN dans la cellule. Bien que des exemples d'interactions ARN-ARN telles que les interactions entre ARNm et ARNm aient montré qu'ils régulent l'expression des gènes, la mesure dans laquelle les interactions ARN se produisent dans la cellule est encore inconnue. Les méthodes antérieures pour étudier les interactions de l'ARN ont principalement porté sur des sous-groupes d'ARN qui interagissent avec une protéine particulière ou des espèces d'ARN. Ici, nous détaillons une méthode appelée S équation de P soralen réticulé, L igated et S élués (SPLASH) qui permettent une capture intégrale des interactions de l'ARN dans le génome in vivo de manière impartiale. SPLASH utilise une réticulation in vivo , une ligature de proximité et un séquençage à haut débit pour identifier globalement les partenaires intramoléculaires et intermoleculaires de base d'ARN. SPLASH peut être appliqué à différents organismes, y compris des bactéries, des levures et des cellules humaines, ainsi qu'uneDes conditions cellulaires diverses pour faciliter la compréhension de la dynamique de l'organisation de l'ARN dans divers contextes cellulaires. L'ensemble du protocole SPLASH expérimental prend environ 5 jours pour être complété et le flux de travail informatique prend environ 7 jours pour être complété.

Introduction

Étudier comment les macromolécules se plient et interagissent entre elles est la clé pour comprendre la régulation des gènes dans la cellule. Bien que de nombreux efforts aient été concentrés au cours de la dernière décennie pour comprendre comment l'ADN et les protéines contribuent à la régulation des gènes, on connaît relativement moins de la régulation post-transcriptionnelle de l'expression des gènes. L'ARN porte des informations à la fois dans sa séquence linéaire et dans sa structure secondaire et tertiaire ¹ . Sa capacité à baser la paire avec elle-même et avec d'autres est importante pour sa fonction in vivo . Les progrès récents dans la sondage de la structure secondaire de l'ARN à haut débit ont fourni des informations précieuses sur les emplacements des régions à double et simple brin dans le transcriptome ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8} , HoweLes informations sur les partenaires d'interaction d'appariement manquent encore. Pour déterminer quelle séquence d'ARN interagit avec une autre région d'ARN dans le transcriptome, nous avons besoin d'informations globales en paire.

La cartographie par paire d'interactions ARN d'une manière globale et impartiale a traditionnellement été un défi majeur. Alors que les approches antérieures, telles que CLASH ⁹ , hiCLIP ¹⁰ et RAP ¹¹ , sont utilisées pour identifier les interactions de l'ARN à grande échelle, ces techniques classent généralement l'association de base d'ARN pour un sous-ensemble d'ARN qui interagissent avec une protéine particulière ou des espèces d'ARN. Les développements récents dans l'étude des interactions globales de l'ARN comprennent la méthode RPL ¹² , qui ne stabilise pas les interactions de l'ARN in vivo et ne peut donc capturer qu'un sous-ensemble d'interactions in vivo . Pour surmonter ces défis, nous et d'autres avons développé des stratégies à l'échelle du génome et impartiales à maP ARNA interagère in vivo , en utilisant des versions modifiées du réticulant psoralen ^{13 , 14 , 15} . Dans ce protocole, nous décrivons les détails pour effectuer l'équation de S de P soralen réticulé, L igated et S élués (SPLASH), qui utilise du psoralène biotinylé pour reticuler l'association des ARN in vivo , suivie d'une ligature de proximité et d'un séquençage à haut débit pour Identifiez les partenaires de base de l'ARN au niveau du génome ( Figure 1 ) ¹⁵ .

Dans ce manuscrit, nous décrivons les étapes pour effectuer SPLASH à l'aide de cellules adhérentes cultivées, dans ce cas, des cellules HeLa. Le même protocole peut être facilement adapté aux cellules de mammifères en suspension et aux cellules de levure et de bactéries. En bref, les cellules HeLa sont traitées avec du psoralène biotinylé et irradiées à 365 nm pour paires de bases d'ARN interactives par liaison croisée in vivo. Les ARN sont ensuite extraits des cellules, fragmentés et enrichis pour les régions de réticulation en utilisant des billes de streptavidine. Les fragments d'ARN interagissant sont ensuite ligaturés ensemble en utilisant une ligature de proximité et transformés en une banque d'ADNc pour un séquençage profond. Lors du séquençage, les ARN chimériques sont mappés sur le transcriptome / génome pour identifier les régions qui interagissent avec l'ARN qui sont couplées l'une à l'autre. Nous avons utilisé SPLASH avec succès pour identifier des milliers d'interactions d'ARN in vivo dans la levure et différentes cellules humaines, y compris le couplage intramoléculaire et intermoleculaire de base d'ARN dans diverses classes d'ARN, tels que snoRNAs, lncRNAs et mRNAs, pour apercevoir l'organisation structurelle et les modèles d'interaction Des ARN dans la cellule.

Protocol

1. Traitement des cellules HeLa avec extraction du psoralène biotinylé et de l'ARN Culture Les cellules HeLa dans le milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) complétées par 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de streptomycine pénicilline (PS) dans une plaque de 10 cm. Lavez les cellules HeLa deux fois avec 5 mL de 1x PBS. Égoutter l'excès de PBS complètement du plat en plaçant le plat verticalement pendant 1 min. Ajouter 1 ml de PBS contenant 200 uM de psoralène…

Representative Results

La figure 1 représente le schéma du flux de travail SPLASH. Lors de l'addition de psoralène biotinylé en présence de 0,01% de digitonine et de réticulation UV, l'ARN total est extrait des cellules et un point-tache est réalisé pour s'assurer que la réticulation du biotinylé à l'ARN s'est produite efficacement ( figure 2 ). Nous utilisons des oligos biotinylés de 20 bases comme témoins positifs po…

Discussion

Ici, nous décrivons en détail le flux de travail expérimental et informatique pour SPLASH, une méthode qui nous permet d'identifier les interactions ARN en paire d'une manière généreuse. Nous avons utilisé avec succès SPLASH dans les cultures bactériennes, de levure et humaines et prévoyons que la stratégie peut être largement appliquée à divers organismes sous différents états cellulaires. L'une des étapes critiques du protocole consiste à commencer par au moins 20 μg d'ARN réticul?…

Materials

1 Kb Plus DNA Ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10787026	DNA ladder
10 bp DNA ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10821-015	DNA ladder
20 % SDS solution	First BASE	BUF-2052-1L
20x SSC	First BASE	BUF-3050-20X1L
3.0 M Sodium Acetate Solution	First BASE	BUF-1151-1L-pH5.2	Required for nucleic acid precipitation
40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1	Bio-Rad	1610145	TBE Urea gel component
Ambion Buffer Kit	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM9010
Ammonium Persulfate, Molecular Grade	Promega	V3131	TBE Urea gel component
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
Chloroform	Merck	1.02445.1000	RNA extraction
Single strand DNA ligase	Epicentre	CL9025K	CircLigase II ssDNA Ligase
Centrifuge tube filters	Sigma-Aldrich	CLS8160-96EA	Costar Spin-X centrifuge tube filters
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE	Sigma-Aldrich	D5628-1G	For cell treatment
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	Dark Reader DR89X Transilluminator	Blue light transilluminator
DNA Gel Loading Dye (6X)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	R0611	Required for agarose gel electroporation
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Pan BioTech	P04-03500	For Hela cell culture
Streptavidin magnetic beads	Life Technologies Holdings Pte Ltd	65002	Dynabeads MyOne Streptavidin C1
Magnetic stand for 15ml tubes	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12301D	DynaMag-15
Magnetic stand for 15ml tubes	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12321D	DynaMag-2
ThermoMixer	Eppendorf	5382 000.015	Eppendorf ThermoMixer C
Biotinylated psoralen	Life Technologies Holdings Pte Ltd	29986	EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin
F8T5/BL	Hitachi	F8T5/BL	365 nm UV bulb
Fetal Bovine Serum	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10270106	Components of Hela medium
Formamide	Promega	H5052	Component in hybridization buffer
G8T5	Sankyo-Denki	G8T5	254 nm UV bulb
Glycogen	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10814010	Required for nucleic acid precipitation
Nanodrop	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Nanodrop 2000	Spectrophotometer for nucleic acidquantification
Nuclease free water	First BASE	BUF-1180-500ml
Penicillin Streptomycin	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15140122	Components of Hela medium
High-Fidelity DNA polymerase (2x)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	F531L	Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x)
Primers Set 1	New England Biolabs	E7335L	PCR primers
DNA Gel Extraction Kit	QIAgen	28106	QIAquick Gel Extraction Kit
Fluorometric Quantification kit	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Q32854	Qubit dsDNA HS Assay Kit
RNA clean up kit	Qiagen	74106	RNeasy Mini Kit Silica-membrane column
Rnase Inhibitor	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM2696	SUPERase In
Reverse transcriptase	Life Technologies Holdings Pte Ltd	18080400	SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix
Nucleic Acid Gel Stain	Life Technologies Holdings Pte Ltd	S11494	SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs	M0201L	End repair enzyme
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L	Enzyme for proximity ligation
T4 RNA Ligase 2, truncated KQ	New England Biolabs	M0373L	Enzyme for adaptor ligation
Temed	Bio-Rad	1610801	TBE Urea gel component
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15596018	TRIzol® Reagent for RNA extraction
Urea	First BASE	BIO-2070-5kg
UV crosslinker	Stratagene	400072	UV Stratalinker 1800
UV Transilluminator	UVP	95-0417-01	For visualizing of bands
Xylene Cyanol FF	Sigma-Aldrich	X4126-10G
DNA cleanup it	Zymo Research	D4004	Zymo DNA concentrator-5
List of software required
FastQC software	0.11.4	http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
SeqPrep software	1.0.7	https://github.com/jstjohn/SeqPrep
BWA software	0.7.12	http://bio-bwa.sourceforge.net/
SAMTOOLS software	1.2.1	http://www.htslib.org/
PULLSEQ software	1.0.2	https://github.com/bcthomas/pullseq
STAR software	2.5.0c	https://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py PYTHON script	PYTHON 2.7.11	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py PYTHON script	PYTHON 2.7.11	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
pickJunctionReads.awk AWK script	AWK GNU 4.1.2	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
Buffer composition
Elution buffer:
0.3 M sodium acetate
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer
100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 7.0
1 mM EDTA
0.5% SDS
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4 °C)
Always add Superase-in fresh before use
2x SSC Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
2X RNA fragmentation buffer
18mM MgCl2
450mM KCl
300mM Tris-CL pH 8.3
2x RNA loading Dye:
95% Formamide
0.02% SDS
0.02% bromophenol blue
0.01% Xylene Cyanol
1mM EDTA
3' RNA adapter sequence	5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC
RT primer sequence	AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG