Mapeando as Interações RNA-ARN Globalmente Usando Psoraleno Biotinilado

Summary

Aqui, detalhamos o método de equação de S de sorgo de P soralen reticulado, L igado e Híbridos H elegidos (SPLASH), que permite o mapeamento genômico de interações intramoleculares e intermoleculares RNA-RNA in vivo . SPLASH pode ser aplicado para estudar os interactomas de RNA de organismos, incluindo leveduras, bactérias e seres humanos.

Abstract

Saber como os RNAs interagem entre si e com os outros é fundamental para entender a regulação genética baseada no RNA na célula. Embora existam exemplos de interacções ARN-ARN, tais como interacções ARNm-ARNm, mostrou-se que regulam a expressão genética, a extensão total em que as interacções ARN ocorrem na célula é ainda desconhecida. Métodos anteriores para estudar as interações de RNA focaram principalmente em subconjuntos de RNAs que estão interagindo com uma determinada proteína ou espécies de RNA. Aqui, detalhamos um método chamado S equenciamento de P soralen reticulado, L igated, e S elegido H ybrids (SPLASH) que permite a captura do genoma de ARN interações in vivo de forma imparcial. SPLASH utiliza reticulação in vivo , ligação de proximidade e sequenciação de alto rendimento para identificar parceiros de ligação de bases de ARN intramoleculares e intermoleculares globalmente. SPLASH pode ser aplicado a diferentes organismos, incluindo bactérias, leveduras e células humanas, bemS diversas condições celulares para facilitar a compreensão da dinâmica da organização do RNA sob diversos contextos celulares. Todo o protocolo SPLASH experimental leva cerca de 5 dias para ser concluído eo fluxo de trabalho computacional leva aproximadamente 7 dias para ser concluído.

Introduction

Estudar como as macromoléculas se dobram e interagem entre si é a chave para a compreensão da regulação genética na célula. Embora muitos esforços tenham sido focados na década passada na compreensão de como o DNA e as proteínas contribuem para a regulação genética, relativamente menos se sabe sobre a regulação pós-transcricional da expressão gênica. O ARN contém informação tanto na sua sequência linear como na sua estrutura secundária e terciária ¹ . Sua capacidade de basear o par com si e com os outros é importante para a sua função in vivo . Os avanços recentes na sondagem de estrutura secundária de RNA de alto rendimento proporcionaram informações valiosas sobre as localizações de regiões duplas e de cadeia simples no transcriptoma ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8} , howeVer informações sobre o emparelhamento interação parceiros ainda está em grande parte ausente. Para determinar qual a sequ�cia de ARN que interage com outra regi� de ARN no transcriptoma, necessitamos de informa�o global de pares.

Mapear par-sábio RNA interações em um global, imparcial forma tem sido tradicionalmente um grande desafio. Embora as abordagens anteriores, tais como CLASH ⁹ , hiCLIP ¹⁰ e RAP ¹¹ , sejam usadas para identificar as interações de RNA em uma maneira de grande escala, essas técnicas tipicamente mapeiam o par de bases de RNA para um subconjunto de RNAs que interagem com uma determinada proteína ou espécies de RNA. Os desenvolvimentos recentes no estudo de interacções de ARN globais incluem o método RPL ¹² , que não estabiliza as interacções de ARN in vivo e, portanto, só pode capturar um subconjunto de interacções in vivo . Para superar esses desafios, nós e outros desenvolvemos estratégias genéticas, semP ARN interacional in vivo , utilizando versões modificadas do reticulador psoraleno ^{13 , 14 , 15} . Neste protocolo, descrevemos os pormenores para realizar a equalização de S de Hélidos H reticulados, S igated e S elegidos por P soralen (SPLASH), que utiliza psoraleno biotinilado para reticular ARNs de emparelhamento de bases in vivo , seguido por ligação de proximidade e sequenciação de alto rendimento a Identificar parceiros de ARN-base de ligação genoma-wide ( Figura 1 ] ¹⁵ .

Neste manuscrito, descrevemos as etapas para realizar SPLASH usando células aderentes cultivadas, neste caso células HeLa. O mesmo protocolo pode ser facilmente adaptado a células de mamífero de suspensão e a células de levedura e bactérias. Resumidamente, as células HeLa são tratadas com psoraleno biotinilado e irradiadas a 365 nm para interligar os pares de bases de ARN em interacção in vivo. Os RNAs são então extraídos das células, fragmentados e enriquecidos para regiões de reticulação usando esferas de estreptavidina. Os fragmentos de ARN que interagem são então ligados em conjunto utilizando ligadura de proximidade e transformados numa biblioteca de cDNA para sequenciação profunda. Após sequenciação, os ARN quiméricos são mapeados no transcriptoma / genoma para identificar as regiões que interagem com o ARN que estão emparelhadas entre si. Utilizamos com sucesso SPLASH para identificar milhares de interações de RNA in vivo em leveduras e diferentes células humanas, incluindo emparelhamento de ARN intramolecular e intermolecular em diversas classes de RNAs, como snoRNAs, lncRNAs e mRNAs, vislumbrando os padrões de organização estrutural e interação De RNAs na célula.

Protocol

1. Tratamento de Células HeLa com Extracção de Psoraleno e ARN Biotinilados Células HeLa de cultura em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina estreptomicina (PS) numa placa de 10 cm. Lavar as células HeLa duas vezes com 5 mL de 1x PBS. Drene excesso de PBS completamente do prato, colocando o prato verticalmente por 1 min. Adicionar 1 mL de PBS contendo 200 μM de psoraleno biotinilado e 0,01% p / v de digitonina, à…

Representative Results

A Figura 1 ilustra o esquema do fluxo de trabalho SPLASH. Após a adição de psoraleno biotinilado na presença de 0,01% de digitonina e reticulação UV, o ARN total é extraído das células e é efectuada uma transferência de pontos para assegurar que a reticulação do biotinilado com o ARN tenha ocorrido eficientemente ( Figura 2 ). Utilizamos oligos biotinilados de 20 bases como controlos positivos para titular a quantid…

Discussion

Aqui, descrevemos em detalhes o fluxo de trabalho experimental e computacional para SPLASH, um método que nos permite identificar par-sábio RNA interações em um genoma-wide maneira. Utilizamos com sucesso SPLASH em bactérias, leveduras e culturas humanas e antecipamos que a estratégia pode ser amplamente aplicada a diversos organismos em diferentes estados celulares. Uma das etapas críticas no protocolo é começar com pelo menos 20 μg de RNA reticulado para ter material adequado para processos a jusante. O ARN …

Materials

1 Kb Plus DNA Ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10787026	DNA ladder
10 bp DNA ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10821-015	DNA ladder
20 % SDS solution	First BASE	BUF-2052-1L
20x SSC	First BASE	BUF-3050-20X1L
3.0 M Sodium Acetate Solution	First BASE	BUF-1151-1L-pH5.2	Required for nucleic acid precipitation
40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1	Bio-Rad	1610145	TBE Urea gel component
Ambion Buffer Kit	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM9010
Ammonium Persulfate, Molecular Grade	Promega	V3131	TBE Urea gel component
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
Chloroform	Merck	1.02445.1000	RNA extraction
Single strand DNA ligase	Epicentre	CL9025K	CircLigase II ssDNA Ligase
Centrifuge tube filters	Sigma-Aldrich	CLS8160-96EA	Costar Spin-X centrifuge tube filters
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE	Sigma-Aldrich	D5628-1G	For cell treatment
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	Dark Reader DR89X Transilluminator	Blue light transilluminator
DNA Gel Loading Dye (6X)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	R0611	Required for agarose gel electroporation
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Pan BioTech	P04-03500	For Hela cell culture
Streptavidin magnetic beads	Life Technologies Holdings Pte Ltd	65002	Dynabeads MyOne Streptavidin C1
Magnetic stand for 15ml tubes	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12301D	DynaMag-15
Magnetic stand for 15ml tubes	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12321D	DynaMag-2
ThermoMixer	Eppendorf	5382 000.015	Eppendorf ThermoMixer C
Biotinylated psoralen	Life Technologies Holdings Pte Ltd	29986	EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin
F8T5/BL	Hitachi	F8T5/BL	365 nm UV bulb
Fetal Bovine Serum	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10270106	Components of Hela medium
Formamide	Promega	H5052	Component in hybridization buffer
G8T5	Sankyo-Denki	G8T5	254 nm UV bulb
Glycogen	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10814010	Required for nucleic acid precipitation
Nanodrop	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Nanodrop 2000	Spectrophotometer for nucleic acidquantification
Nuclease free water	First BASE	BUF-1180-500ml
Penicillin Streptomycin	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15140122	Components of Hela medium
High-Fidelity DNA polymerase (2x)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	F531L	Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x)
Primers Set 1	New England Biolabs	E7335L	PCR primers
DNA Gel Extraction Kit	QIAgen	28106	QIAquick Gel Extraction Kit
Fluorometric Quantification kit	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Q32854	Qubit dsDNA HS Assay Kit
RNA clean up kit	Qiagen	74106	RNeasy Mini Kit Silica-membrane column
Rnase Inhibitor	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM2696	SUPERase In
Reverse transcriptase	Life Technologies Holdings Pte Ltd	18080400	SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix
Nucleic Acid Gel Stain	Life Technologies Holdings Pte Ltd	S11494	SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs	M0201L	End repair enzyme
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L	Enzyme for proximity ligation
T4 RNA Ligase 2, truncated KQ	New England Biolabs	M0373L	Enzyme for adaptor ligation
Temed	Bio-Rad	1610801	TBE Urea gel component
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15596018	TRIzol® Reagent for RNA extraction
Urea	First BASE	BIO-2070-5kg
UV crosslinker	Stratagene	400072	UV Stratalinker 1800
UV Transilluminator	UVP	95-0417-01	For visualizing of bands
Xylene Cyanol FF	Sigma-Aldrich	X4126-10G
DNA cleanup it	Zymo Research	D4004	Zymo DNA concentrator-5
List of software required
FastQC software	0.11.4	http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
SeqPrep software	1.0.7	https://github.com/jstjohn/SeqPrep
BWA software	0.7.12	http://bio-bwa.sourceforge.net/
SAMTOOLS software	1.2.1	http://www.htslib.org/
PULLSEQ software	1.0.2	https://github.com/bcthomas/pullseq
STAR software	2.5.0c	https://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py PYTHON script	PYTHON 2.7.11	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py PYTHON script	PYTHON 2.7.11	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
pickJunctionReads.awk AWK script	AWK GNU 4.1.2	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
Buffer composition
Elution buffer:
0.3 M sodium acetate
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer
100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 7.0
1 mM EDTA
0.5% SDS
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4 °C)
Always add Superase-in fresh before use
2x SSC Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
2X RNA fragmentation buffer
18mM MgCl2
450mM KCl
300mM Tris-CL pH 8.3
2x RNA loading Dye:
95% Formamide
0.02% SDS
0.02% bromophenol blue
0.01% Xylene Cyanol
1mM EDTA
3' RNA adapter sequence	5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC
RT primer sequence	AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG