Сопоставление взаимодействия РНК-РНК в глобальном масштабе с использованием биотинилированного псоралена
Summary
Здесь мы подробно остановимся на способе S- выравнивания P soralen, сшитого, Ligated, и S, выбранного H ybrids (SPLASH), который позволяет проводить генома внутримолекулярные и межмолекулярные взаимодействия РНК-РНК in vivo . SPLASH может применяться для изучения РНК-взаимодействий организмов, включая дрожжи, бактерии и людей.
Abstract
Зная, как РНК взаимодействуют с собой и с другими, является ключом к пониманию регуляции генов на основе РНК в клетке. Несмотря на то, что примеры взаимодействия РНК-РНК, такие как взаимодействия микроРНК-мРНК, как было показано, регулируют экспрессию генов, полная степень взаимодействия РНК в клетке остается неизвестной. Предыдущие методы изучения взаимодействий РНК были в основном сосредоточены на подмножествах РНК, которые взаимодействуют с конкретным видом белка или РНК. Здесь мы подробно описываем метод, названный S, состоящий из P soralen, сшитого, Ligated, и S, избранных H ybrids (SPLASH), который позволяет геномному захвату взаимодействий РНК in vivo беспристрастно. SPLASH использует in vivo сшивание, лигирование близости и высокую пропускную последовательность для идентификации внутримолекулярных и межмолекулярных партнеров по связыванию оснований РНК в глобальном масштабе. SPLASH может применяться для различных организмов, включая бактерии, дрожжи и клетки человека, а такжеС тем чтобы облегчить понимание динамики организации РНК в различных клеточных контекстах. Весь экспериментальный протокол SPLASH занимает около 5 дней, а процесс вычисления занимает около 7 дней.
Introduction
Изучение того, как макромолекулы складываются и взаимодействуют друг с другом, является ключом к пониманию регуляции генов в клетке. Несмотря на то, что в последнее десятилетие были предприняты значительные усилия для понимания того, как ДНК и белки способствуют регуляции генов, относительно меньше посттранскрипционной регуляции экспрессии генов известно относительно меньше. РНК несет информацию как в своей линейной последовательности, так и в ее вторичной и третичной структуре 1 . Его способность основывать пар с собой и с другими имеет важное значение для его функции in vivo . Недавние успехи в зондировании вторичной структуры с высокой пропускной способностью РНК дали ценную информацию о расположении двойных и одноцепочечных областей в транскриптоме 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , howeВерная информация о партнерах по парному взаимодействию все еще в значительной степени отсутствует. Чтобы определить, какая последовательность РНК взаимодействует с другой областью РНК в транскриптоме, нам нужна глобальная парная информация.
Традиционно картографирование парных взаимодействий РНК глобальным, беспристрастным образом является серьезной проблемой. В то время как предыдущие подходы, такие как CLASH 9 , hiCLIP 10 и RAP 11 , используются для идентификации взаимодействий РНК широкомасштабным образом, эти методы обычно отображают спаривание оснований РНК для подмножества РНК, которые либо взаимодействуют с конкретным видом белка, либо РНК. Недавние разработки в изучении взаимодействий в глобальной РНК включают метод RPL 12 , который не стабилизирует взаимодействия РНК in vivo и, следовательно, может захватывать только часть взаимодействий in vivo . Чтобы преодолеть эти трудности, мы и другие разработали универсальные, беспристрастные стратегии для маР-РНК взаимодействует in vivo с использованием модифицированных вариантов сшивающего агента psoralen 13 , 14 , 15 . В этом протоколе мы описываем детали для выполнения S- согласования P сoralen сшитого, Ligated и S выбранных H ybrids (SPLASH), который использует биотинилированный псорален для сшивания базовых спаривающих РНК in vivo с последующим лигированием близости и высокой пропускной последовательностью, чтобы Идентифицировать партнеров по связыванию с основанием РНК по всему геному ( Рисунок 1 ) 15 .
В этой рукописи мы описываем шаги для выполнения SPLASH с использованием культивируемых клеток-приверженцев, в данном случае клеток HeLa. Тот же протокол может быть легко адаптирован к суспензионным клеткам млекопитающих и дрожжевым и бактериальным клеткам. Вкратце, клетки HeLa обрабатывают биотинилированным псораленом и облучают при 365 нм для сшивания взаимодействующих пар оснований РНК in vivo, РНК затем экстрагируют из клеток, фрагментируют и обогащают для сшивания областей, используя стрептавидиновые гранулы. Взаимодействующие фрагменты РНК затем лигируют вместе с использованием лигирования по близости и превращают в библиотеку кДНК для глубокого секвенирования. После секвенирования химерные РНК отображаются на транскриптом / геном, чтобы идентифицировать области взаимодействия РНК, которые спарены друг с другом. Мы успешно использовали SPLASH для идентификации тысяч взаимодействий РНК in vivo у дрожжей и различных человеческих клеток, включая внутримолекулярное и межмолекулярное спаривание РНК в различных классах РНК, таких как snoRNAs, lncRNAs и мРНК, чтобы заглянуть в структурную организацию и образцы взаимодействия РНК в клетке.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы подробно опишем экспериментальный и вычислительный рабочий процесс для SPLASH, метод, который позволяет нам идентифицировать парные взаимодействия РНК в геномо-широкой манере. Мы успешно использовали SPLASH в бактериальных, дрожжевых и человеческих культурах и ожидаем, что эта ст?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим членов лаборатории Wan и лаборатории Nagarajan за содержательные обсуждения. Финансирование NNARARAN поддерживается A * STAR. Y.Wan поддерживается при финансовой поддержке A * STAR и Общества в науке – стипендии Бранко Вайсс.
Materials
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10787026 | DNA ladder |
| 10 bp DNA ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10821-015 | DNA ladder |
| 20 % SDS solution | First BASE | BUF-2052-1L | |
| 20x SSC | First BASE | BUF-3050-20X1L | |
| 3.0 M Sodium Acetate Solution | First BASE | BUF-1151-1L-pH5.2 | Required for nucleic acid precipitation |
| 40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 | Bio-Rad | 1610145 | TBE Urea gel component |
| Ambion Buffer Kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM9010 | |
| Ammonium Persulfate, Molecular Grade | Promega | V3131 | TBE Urea gel component |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Chloroform | Merck | 1.02445.1000 | RNA extraction |
| Single strand DNA ligase | Epicentre | CL9025K | CircLigase II ssDNA Ligase |
| Centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8160-96EA | Costar Spin-X centrifuge tube filters |
| D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE | Sigma-Aldrich | D5628-1G | For cell treatment |
| Dark Reader Transilluminator | Clare Chemical Research | Dark Reader DR89X Transilluminator | Blue light transilluminator |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | R0611 | Required for agarose gel electroporation |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Pan BioTech | P04-03500 | For Hela cell culture |
| Streptavidin magnetic beads | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 65002 | Dynabeads MyOne Streptavidin C1 |
| Magnetic stand for 15ml tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12301D | DynaMag-15 |
| Magnetic stand for 15ml tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12321D | DynaMag-2 |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5382 000.015 | Eppendorf ThermoMixer C |
| Biotinylated psoralen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 29986 | EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin |
| F8T5/BL | Hitachi | F8T5/BL | 365 nm UV bulb |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10270106 | Components of Hela medium |
| Formamide | Promega | H5052 | Component in hybridization buffer |
| G8T5 | Sankyo-Denki | G8T5 | 254 nm UV bulb |
| Glycogen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10814010 | Required for nucleic acid precipitation |
| Nanodrop | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Nanodrop 2000 | Spectrophotometer for nucleic acidquantification |
| Nuclease free water | First BASE | BUF-1180-500ml | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15140122 | Components of Hela medium |
| High-Fidelity DNA polymerase (2x) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | F531L | Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x) |
| Primers Set 1 | New England Biolabs | E7335L | PCR primers |
| DNA Gel Extraction Kit | QIAgen | 28106 | QIAquick Gel Extraction Kit |
| Fluorometric Quantification kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Q32854 | Qubit dsDNA HS Assay Kit |
| RNA clean up kit | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini Kit Silica-membrane column |
| Rnase Inhibitor | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM2696 | SUPERase In |
| Reverse transcriptase | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 18080400 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix |
| Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies Holdings Pte Ltd | S11494 | SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | End repair enzyme |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | Enzyme for proximity ligation |
| T4 RNA Ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373L | Enzyme for adaptor ligation |
| Temed | Bio-Rad | 1610801 | TBE Urea gel component |
| Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15596018 | TRIzol® Reagent for RNA extraction |
| Urea | First BASE | BIO-2070-5kg | |
| UV crosslinker | Stratagene | 400072 | UV Stratalinker 1800 |
| UV Transilluminator | UVP | 95-0417-01 | For visualizing of bands |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
| DNA cleanup it | Zymo Research | D4004 | Zymo DNA concentrator-5 |
| List of software required | |||
| FastQC software | 0.11.4 | http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | |
| SeqPrep software | 1.0.7 | https://github.com/jstjohn/SeqPrep | |
| BWA software | 0.7.12 | http://bio-bwa.sourceforge.net/ | |
| SAMTOOLS software | 1.2.1 | http://www.htslib.org/ | |
| PULLSEQ software | 1.0.2 | https://github.com/bcthomas/pullseq | |
| STAR software | 2.5.0c | https://github.com/alexdobin/STAR | |
| rem_dups.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| find_chimeras.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| pickJunctionReads.awk AWK script | AWK GNU 4.1.2 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| Buffer composition | |||
| Elution buffer: | |||
| 0.3 M sodium acetate | |||
| Lysis Buffer: | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 10 mM EDTA | |||
| 1% SDS | |||
| Always add Superase-in fresh before use except when washing beads | |||
| Proteinase K Buffer | |||
| 100 mM NaCl | |||
| 10 mM TrisCl pH 7.0 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 0.5% SDS | |||
| Hybridization Buffer | |||
| 750 mM NaCl | |||
| 1% SDS | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 15% formamide (store in the dark at 4 °C) | |||
| Always add Superase-in fresh before use | |||
| 2x SSC Wash Buffer | |||
| 2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock) | |||
| 0.5% SDS | |||
| 2X RNA fragmentation buffer | |||
| 18mM MgCl2 | |||
| 450mM KCl | |||
| 300mM Tris-CL pH 8.3 | |||
| 2x RNA loading Dye: | |||
| 95% Formamide | |||
| 0.02% SDS | |||
| 0.02% bromophenol blue | |||
| 0.01% Xylene Cyanol | |||
| 1mM EDTA | |||
| 3' RNA adapter sequence | 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC | ||
| RT primer sequence | AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG |
References
- Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. Understanding the transcriptome through RNA structure. Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).
- Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).
- Wan, Y., et al. Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies. Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).
- Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing. Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).
- Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).
- Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).
- Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).
- Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
- Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).
- Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
- Engreitz, J. M., et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites. Cell. 159 (1), 188-199 (2014).
- Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation. Nat.Biotechnol. , (2015).
- Lu, Z., et al. RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure. Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).
- Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O’Hanlon, D., Blencowe, B. J. Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions. Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).
- Aw, J. G., et al. In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation. Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).
