RNA-RNA Etkileşmelerini Biyotinlenmiş Psooren Kullanarak Küresel Olarak Haritalama
Summary
Burada, intramoleküler ve molekül içi RNA-RNA etkileşimlerinin in vivo genom geneli haritalamasını mümkün kılan P soralen çapraz bağlanmış, L ve s seçilmiş H zincirlerinin (SPLASH) eşitliğinin yöntemini ayrıntılı olarak açıklıyoruz. SPLASH maya, bakteri ve insanlar dahil olmak üzere organizmaların RNA etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir.
Abstract
RNA'ların kendileriyle ve diğerleriyle nasıl etkileşime girdiğini bilmek, hücredeki RNA esaslı gen düzenlenişini anlamanın anahtarıdır. MikroRNA-mRNA etkileşimleri gibi RNA-RNA etkileşimlerinin örneklerinin gen ekspresyonunu düzenlediği gösterilmiş olsa da, RNA etkileşimlerinin hücrede oluştuğu tam olarak bilinmemektedir. RNA etkileşimlerini incelemek için önceki yöntemler, öncelikle belirli bir protein veya RNA türü ile etkileşime giren RNA altkümelerine odaklanmıştır. Burada, RNA etkileşimlerini in vivo olarak tarafsız bir şekilde yakalamaya yarayan P soralen çapraz bağlanmış, L ve S seçilmiş H zincirlerine (SPLASH) denk gelen bir yöntem ayrıntılı. SPLASH, intramoleküler ve moleküller arası RNA baz eşleştirme partnerlerini küresel olarak tanımlamak için, in vivo çapraz bağlama, yakınlık ligasyonu ve yüksek verimli sıralama kullanmaktadır. SPLASH bakteri, maya ve insan hücreleri de dahil olmak üzere farklı organizmalara uygulanabilir.Farklı hücresel bağlamlarda RNA organizasyon dinamikleri anlayışını kolaylaştırmak için çeşitli hücresel koşullar. Tüm deneysel SPLASH protokolünün tamamlanması yaklaşık 5 gün sürer ve hesaplama iş akışının tamamlanması yaklaşık 7 gün sürer.
Introduction
Makromoleküllerin birbirleriyle nasıl katlandığını ve etkileşim kurduğunu incelemek, hücredeki gen düzenlenişini anlamak için anahtardır. DNA ve proteinlerin gen regülasyonuna nasıl katkıda bulunduğunu anlama konusunda son on yılda çok fazla çaba sarf edilmesine rağmen, gen ifadesinin transkripsiyon sonrası regülasyonu hakkında nispeten daha az şey bilinmektedir. RNA hem doğrusal sekansında hem de sekonder ve tersiyer yapıda bilgi taşır 1 . Kendisi ve başkaları ile çiftleşebilme kabiliyeti , in vivo fonksiyonu için önemlidir. Yüksek verimli RNA ikincil yapı taramasındaki son gelişmeler, transkriptomda 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , howe'deki çift ve tek sarmal bölgelerin yerlerine değerli bilgiler sağlamıştırEşleştirme etkileşimi ortakları hakkındaki ver bilgileri hala büyük ölçüde eksiktir. Hangi RNA sekansının transkriptomdaki başka bir RNA bölgesi ile etkileşime girdiğini belirlemek için küresel çaplı bilgiye ihtiyacımız var.
Çift-bazlı RNA etkileşimlerini küresel, tarafsız bir şekilde haritalamak geleneksel olarak büyük bir mücadele olmuştur. CLASH 9 , hiCLIP 10 ve RAP 11 gibi daha önceki yaklaşımlar RNA etkileşimlerini büyük ölçekte tanımlamak için kullanılırken, bu teknikler tipik olarak belirli bir protein veya RNA türü ile etkileşime giren bir RNA alt kümesi için RNA baz eşleştirmesini eşleştirir. Küresel RNA etkileşimlerinin incelenmesindeki son gelişmeler, RNA etkileşimlerini in vivo olarak stabilize etmeyen ve dolayısıyla sadece in vivo etkileşimlerin bir alt kümesini yakalayabilen RPL 12 yöntemini içerir. Bu zorlukların üstesinden gelmek için biz ve diğerleri genom çapında, tarafsız stratejiler geliştirdiler.P RNA , in vivo olarak, çapraz bağlayıcı psoralen 13 , 14 , 15'in değiştirilmiş versiyonları kullanılarak etkileşir. Bu protokolde, baz eşleştirme RNA'larını in vivo çapraz bağlamak için biyotinlenmiş psooren kullanan P soralen çapraz bağlanmış, L ve s seçilmiş H zincirlerinin (SPLASH) eşitliğinin gerçekleştirilmesine ilişkin ayrıntıları, ardından proximity ligasyonu ve yüksek işleme sıralamasını RNA baz eşleştirme ortaklarını genom çapında tanımlayın ( Şekil 1 ) 15 .
Bu yazıda, kültürlü adherent hücreleri (bu durumda HeLa hücreleri) kullanarak SPLASH'ı gerçekleştirmek için gerekli adımları anlatacağız. Aynı protokol süspansiyon memeli hücrelerine ve maya ve bakteri hücrelerine kolaylıkla uyarlanabilir. Kısaca, HeLa hücreleri biotinile psoralen ile muamele edilir ve in vivo etkileşen RNA baz çiftlerini çapraz bağlamak için 365 nm'de ışınlanır. RNA'lar daha sonra hücrelerden çıkarılır, parçalanır ve streptavidin boncukları kullanılarak çapraz bağlanma bölgesi için zenginleştirilir. Etkileşen RNA parçaları daha sonra yakınlık ligasyonu kullanılarak bağlanır ve derin sekanslama için bir cDNA kütüphanesine dönüştürülür. Sıralamada, kimerik RNA'lar, birbirlerine eşleştirilen RNA etkileşimli bölgelerin tanımlanması için transkriptom / genom üzerine eşlenir. Yapısal organizasyon ve etkileşim kalıplarına göz atmak için snoRNA'lar, lncRNA'lar ve mRNA'lar gibi farklı RNA sınıflarında intramoleküler ve moleküller arası RNA baz eşleştirmesi de dahil olmak üzere , mayada ve farklı insan hücrelerinde in vivo olarak binlerce RNA etkileşimini tanımlamak için SPLASH'ı başarıyla kullandık. Hücredeki RNA'ların
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, çift-bilge RNA etkileşimlerini genom çapında tanımlamamızı sağlayan bir yöntem olan SPLASH için deneysel ve hesaplamalı iş akışını detaylı olarak açıklıyoruz. Bakteri, maya ve insan kültürlerinde SPLASH'ı başarıyla kullandık ve stratejinin farklı hücresel koşullar altında çeşitli organizmalara yaygın olarak uygulanabileceğini öngörüyoruz. Protokoldeki kritik adımlardan biri, aşağı akış süreçleri için yeterli materyali elde etmek için en az 20 μg çapraz bağlan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bilgilendirici tartışmalar için Wan laboratuvarının üyeleri ve Nagarajan laboratuvarına teşekkür ediyoruz. N.Nagarajan, A * STAR'ın finansmanı ile desteklenmektedir. Y.Wan, A * STAR ve Society of Science-Branco Weiss Kardeşliği fonlarından desteklenmektedir.
Materials
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10787026 | DNA ladder |
| 10 bp DNA ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10821-015 | DNA ladder |
| 20 % SDS solution | First BASE | BUF-2052-1L | |
| 20x SSC | First BASE | BUF-3050-20X1L | |
| 3.0 M Sodium Acetate Solution | First BASE | BUF-1151-1L-pH5.2 | Required for nucleic acid precipitation |
| 40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 | Bio-Rad | 1610145 | TBE Urea gel component |
| Ambion Buffer Kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM9010 | |
| Ammonium Persulfate, Molecular Grade | Promega | V3131 | TBE Urea gel component |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Chloroform | Merck | 1.02445.1000 | RNA extraction |
| Single strand DNA ligase | Epicentre | CL9025K | CircLigase II ssDNA Ligase |
| Centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8160-96EA | Costar Spin-X centrifuge tube filters |
| D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE | Sigma-Aldrich | D5628-1G | For cell treatment |
| Dark Reader Transilluminator | Clare Chemical Research | Dark Reader DR89X Transilluminator | Blue light transilluminator |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | R0611 | Required for agarose gel electroporation |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Pan BioTech | P04-03500 | For Hela cell culture |
| Streptavidin magnetic beads | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 65002 | Dynabeads MyOne Streptavidin C1 |
| Magnetic stand for 15ml tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12301D | DynaMag-15 |
| Magnetic stand for 15ml tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12321D | DynaMag-2 |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5382 000.015 | Eppendorf ThermoMixer C |
| Biotinylated psoralen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 29986 | EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin |
| F8T5/BL | Hitachi | F8T5/BL | 365 nm UV bulb |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10270106 | Components of Hela medium |
| Formamide | Promega | H5052 | Component in hybridization buffer |
| G8T5 | Sankyo-Denki | G8T5 | 254 nm UV bulb |
| Glycogen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10814010 | Required for nucleic acid precipitation |
| Nanodrop | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Nanodrop 2000 | Spectrophotometer for nucleic acidquantification |
| Nuclease free water | First BASE | BUF-1180-500ml | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15140122 | Components of Hela medium |
| High-Fidelity DNA polymerase (2x) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | F531L | Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x) |
| Primers Set 1 | New England Biolabs | E7335L | PCR primers |
| DNA Gel Extraction Kit | QIAgen | 28106 | QIAquick Gel Extraction Kit |
| Fluorometric Quantification kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Q32854 | Qubit dsDNA HS Assay Kit |
| RNA clean up kit | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini Kit Silica-membrane column |
| Rnase Inhibitor | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM2696 | SUPERase In |
| Reverse transcriptase | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 18080400 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix |
| Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies Holdings Pte Ltd | S11494 | SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | End repair enzyme |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | Enzyme for proximity ligation |
| T4 RNA Ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373L | Enzyme for adaptor ligation |
| Temed | Bio-Rad | 1610801 | TBE Urea gel component |
| Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15596018 | TRIzol® Reagent for RNA extraction |
| Urea | First BASE | BIO-2070-5kg | |
| UV crosslinker | Stratagene | 400072 | UV Stratalinker 1800 |
| UV Transilluminator | UVP | 95-0417-01 | For visualizing of bands |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
| DNA cleanup it | Zymo Research | D4004 | Zymo DNA concentrator-5 |
| List of software required | |||
| FastQC software | 0.11.4 | http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | |
| SeqPrep software | 1.0.7 | https://github.com/jstjohn/SeqPrep | |
| BWA software | 0.7.12 | http://bio-bwa.sourceforge.net/ | |
| SAMTOOLS software | 1.2.1 | http://www.htslib.org/ | |
| PULLSEQ software | 1.0.2 | https://github.com/bcthomas/pullseq | |
| STAR software | 2.5.0c | https://github.com/alexdobin/STAR | |
| rem_dups.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| find_chimeras.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| pickJunctionReads.awk AWK script | AWK GNU 4.1.2 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| Buffer composition | |||
| Elution buffer: | |||
| 0.3 M sodium acetate | |||
| Lysis Buffer: | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 10 mM EDTA | |||
| 1% SDS | |||
| Always add Superase-in fresh before use except when washing beads | |||
| Proteinase K Buffer | |||
| 100 mM NaCl | |||
| 10 mM TrisCl pH 7.0 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 0.5% SDS | |||
| Hybridization Buffer | |||
| 750 mM NaCl | |||
| 1% SDS | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 15% formamide (store in the dark at 4 °C) | |||
| Always add Superase-in fresh before use | |||
| 2x SSC Wash Buffer | |||
| 2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock) | |||
| 0.5% SDS | |||
| 2X RNA fragmentation buffer | |||
| 18mM MgCl2 | |||
| 450mM KCl | |||
| 300mM Tris-CL pH 8.3 | |||
| 2x RNA loading Dye: | |||
| 95% Formamide | |||
| 0.02% SDS | |||
| 0.02% bromophenol blue | |||
| 0.01% Xylene Cyanol | |||
| 1mM EDTA | |||
| 3' RNA adapter sequence | 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC | ||
| RT primer sequence | AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG |
References
- Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. Understanding the transcriptome through RNA structure. Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).
- Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).
- Wan, Y., et al. Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies. Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).
- Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing. Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).
- Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).
- Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).
- Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).
- Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
- Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).
- Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
- Engreitz, J. M., et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites. Cell. 159 (1), 188-199 (2014).
- Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation. Nat.Biotechnol. , (2015).
- Lu, Z., et al. RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure. Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).
- Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O’Hanlon, D., Blencowe, B. J. Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions. Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).
- Aw, J. G., et al. In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation. Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).
