ターゲットを絞りました<em>その場で</em出芽酵母におけるヒストン遺伝子の>突然変異誘発
Summary
A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.
Abstract
We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.
Introduction
4つのコアヒストンタンパク質H2A、H2B、H3、およびH4は、真核生物の染色体の締固め、組織、および機能において中心的な役割を果たしています。これらのヒストンのそれぞれの二組は、最終的にヌクレオソーム1の形成をもたらす、ヒストン八量体、自身の周囲のDNAの〜147塩基対の折り返しを指示する分子スプールを形成します。ヌクレオソームは、そのような遺伝子転写の調節および染色体全体のユークロマチンとヘテロクロマチンの形成と染色体ベースのプロセスの様々な積極的な参加者であり、そのように、過去数十年にわたって集中的な研究の焦点となっています。これらの機構は、ヒストン残基、ATP依存的ヌクレオソームのリモデリング、およびATP非依存性ヌクレオソーム再編成の翻訳後修飾を含む – の機構の数がヌクレオソームは、特定のプロセスの実行を容易にすることができる方法で操作することができるによって記載されています及び組立/分解2,3。
出芽酵母サッカロマイセス・セレビシエは、真核生物におけるヒストンの機能を理解するために、特に強力なモデル生物です。これは主に遺伝的および生化学的実験の様々なドメイン真核生物および酵母の従順を通して、ヒストンタンパク質の進化的保存の高度に帰することができる4に近づきます。酵母における逆遺伝的アプローチは広くクロマチン生物学のさまざまな側面に関する特定のヒストン変異の影響を研究するために使用されてきました。実験のこれらのタイプのためには、自律的なプラスミドからの発現は、ヒストンタンパク質の異常な細胞内レベルにつながることができますように（これは細胞内でのプラスミドの様々な数に）、変異型ヒストンが母国のゲノム遺伝子座から発現される細胞を使用することが好ましいことが多いとクロマチンアンの同時変更最終的には結果の解釈を混乱することができvironments、。
ここでは、ゲノム中の残りの外因性DNA配列せずに所望の変異（複数可）の生成にクローニングステップと結果を必要としないそれらの天然ゲノム位置でのヒストン遺伝子の標的突然変異誘発を可能にするPCRベースの技術が記載されています。この技術は、酵母内で効率的な相同組換え系を利用し、他のグループによって開発された他の同様の技術と共通のいくつかの機能があります-最も顕著Delitto PERFETTO、サイト固有のゲノム（SSG）突然変異誘発、およびクローニングのないPCRに基づく対立遺伝子を代替法5、6、7。しかし、私たちが説明する手法は、特にヒストン遺伝子の突然変異誘発のために非常に適しせる側面を持っています。半数体酵母細胞では、4つのコアヒストンの各々は、二つの非Aによりコードされますllelicと相同性の高い遺伝子は、たとえば、ヒストンH3はHHT1とHHT2遺伝子によってコードされ、そして2つの遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）は、シーケンス内の90％以上同一です。相同性のこの高度に特異的突然変異誘発のための2つのヒストンをコードする遺伝子のいずれかを標的とするように設計された実験を複雑にすることができます。上述の方法は、多くの場合、相同組換えを駆動するために、標的遺伝子のORF内の少なくともいくつかの配列の使用を必要とするのに対し、ここで説明する技術は、のために（非常に少ない配列相同性を共有する）ヒストン遺伝子のORFに隣接する配列を利用します組換え工程は、所望の遺伝子座に突然変異誘発の成功した標的化の可能性を高めます。また、再結合を駆動相同領域は、さらに効率的な標的相同組換えに貢献し、非常に広範であることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
一倍体S.セレビシエ細胞における4つのコアヒストンタンパク質のそれぞれのコードは、具体的突然変異誘発のための2つの遺伝子のいずれかをターゲットにする研究者のための挑戦を表すことができる2つの非対立遺伝子間の配列相同性の高レベル。以前は頻繁に依存し、Delitto PERFETTO、サイト固有のゲノム（SSG）突然変異誘発、およびクローニングのないPCRに基づく対立遺伝子交?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Reine Protacio for helpful comments during the preparation of this manuscript. We express our gratitude to the National Science Foundation (grants nos. 1243680 and 1613754) and the Hendrix College Odyssey Program for funding support.
Materials
| 1 kb DNA Ladder (DNA standards) | New England BioLabs | N3232L | |
| Agarose | Sigma | A5093-100G | |
| Boric Acid | Sigma | B0394-500G | |
| dNTP mix (10 mM each) | ThermoFisher Scientific | R0192 | |
| EDTA solution (0.5M, pH 8.0) | AmericanBio | AB00502-01000 | |
| Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | 16-100-824 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E4884-500G | |
| Lithium acetate dihydrate | Sigma | L6883-250G | |
| MyCycler Thermal Cycler | BioRad | 170-9703 | |
| Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma | P3640-1KG | |
| PrimeSTAR HS DNA Polymerase (high fidelity DNA polymerase) and 5X buffer | Fisher Scientific | 50-443-960 | |
| Salmon sperm DNA solution | ThermoFisher Scientific | 15632-011 | |
| Sigma 7-9 (Tris base, powder form) | Sigma | T1378-1KG | |
| Sodium acetate trihydrate | Sigma | 236500-500G | |
| Supra Sieve GPG Agarose (low metling temperature agarose) | AmericanBio | AB00985-00100 | |
| Taq Polymerase and 10X Buffer | New England BioLabs | M0273X | |
| Toothpicks | Fisher Scientific | S67859 | |
| Tris-HCl (1M, pH 8.0) | AmericanBio | AB14043-01000 | |
| a-D(+)-Glucose | Fisher Scientific | AC170080025 | for yeast media |
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | for yeast media |
| Peptone | Fisher Scientific | DF0118-07-2 | for YPD medium |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | DF0127-17-9 | for YPD medium |
| 4-aminobenzoic acid | Sigma | A9878-100G | for complete minimal dropout medium |
| Adenine | Sigma | A8626-100G | for complete minimal dropout medium |
| Glycine hydrochloride | Sigma | G2879-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Alanine | Sigma | A7627-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Arginine monohydrochloride | Sigma | A5131-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Asparagine monohydrate | Sigma | A8381-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Aspartic acid sodium salt monohydrate | Sigma | A6683-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Glutamic acid hydrochloride | Sigma | G2128-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Glutamine | Sigma | G3126-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma | H8125-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Isoleucine | Sigma | I2752-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Leucine | Sigma | L8000-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma | L5626-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Methionine | Sigma | M9625-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Phenylalanine | Sigma | P2126-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Proline | Sigma | P0380-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Serine | Sigma | S4500-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Threonine | Sigma | T8625-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Tryptophan | Sigma | T0254-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Tyrosine | Sigma | T3754-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Valine | Sigma | V0500-100G | for complete minimal dropout medium |
| myo-Inositol | Sigma | I5125-100G | for complete minimal dropout medium |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | for complete minimal dropout medium |
| Ammonium Sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | for complete minimal dropout medium |
| Yeast Nitrogen Base | Fisher Scientific | DF0919-07-3 | for complete minimal dropout medium |
| 5-Fluoroorotic acid (5-FOA) | AmericanBio | AB04067-00005 | for 5-FOA medium |
References
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