målrettet<em> I Situ</em> mutagenese av Histone Gener i Budding Gjær

Summary

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Abstract

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Introduction

De fire kjerne histonproteinene H2A, H2B, H3 og H4 spille sentrale roller i komprimering, organisasjon og funksjon av eukaryote kromosomer. To sett med hvert av disse histoner danner histon octamer, en molekyl spole som styrer innpakning av ~ 147 basepar av DNA rundt seg selv, til slutt resulterer i dannelsen av en nucleosome ^1. Nukleosomer er aktive deltakere i en rekke kromosombaserte prosesser, for eksempel regulering av gentranskripsjon og dannelse av eukromatin og heterochromatin tvers kromosomer, og som sådan har vært fokus for intens forskning i løpet av de siste tiårene. Et antall mekanismer har blitt beskrevet av hvilken nukleosomer kan manipuleres på måter som kan lette gjennomføring av spesifikke prosesser – disse mekanismene omfatter posttranslasjonell modifikasjon av histon-rester, ATP-avhengige nucleosome remodellering, og ATP-uavhengig nucleosome reorganiseringog montering / demontering ^{to, tre.}

Den spirende gjær Saccharomyces cerevisiae er en spesielt kraftig modellorganisme for forståelsen av histone funksjon i eukaryoter. Dette kan i stor grad tilskrives den høye graden av evolusjonære bevaring av histonproteinene hele domenet eukarya og amenability av gjær til en rekke genetiske og biokjemiske eksperimentelle tilnærminger ^fire. Omvendt-genetiske tilnærminger i gjær har blitt mye brukt til å studere effekter av spesifikke histone mutasjoner på ulike aspekter av kromatin biologi. For disse typer av forsøk er det ofte foretrukket å anvende celler i hvilke de mutante histoner er uttrykt fra sitt opprinnelige genomiske loci, som uttrykk fra autonome plasmider kan føre til unormale intracellulære nivåer av histonproteinene (på grunn av varierende antall plasmider i celler) og samtidig endring av kromatin novironments, som kan til slutt skamme tolkningen av resultatene.

Her beskriver vi en PCR-basert teknikk som gjør det mulig for målrettet mutagenese av histpngenene ved sine opprinnelige genomiske steder som ikke krever en kloningstrinn og resulterer i dannelsen av den ønskede mutasjon (er) uten tiloversblevne eksogene DNA-sekvenser i genomet. Denne teknikken utnyttet effektivt homolog rekombinasjon system i gjær og har flere fellestrekk med andre lignende teknikker utviklet av andre grupper – først og fremst Delitto Perfetto, stedsspesifikke genomisk (SSG) mutagenese, og kloning frie PCR-basert allelet erstatning metoder ^{5, 6, 7.} Imidlertid teknikken beskriver vi har et aspekt som gjør det spesielt godt egnet for mutagenese av histon gener. I haploide gjærceller, blir hver av de fire kjerne histoner kodet for av to ikke-enllelic og sterkt homologe gener, for eksempel, er histon H3 kodet av de HHT1 og HHT2 gener, og de åpne leserammer (ORF) av de to gener er over 90% identisk i sekvens. Denne høye grad av homologi kan komplisere forsøk utformet for å spesifikt mot en av de to histon-kodende gener for mutagenese. Mens de ovennevnte metoder krever ofte anvendelse av i det minste noen sekvenser innenfor ORF av målgenet for å drive homolog rekombinasjon, teknikken beskrives her gjør bruk av sekvenser som flankerer ORF av histpngenene (som deler mye mindre sekvenshomologi) for rekombinasjon trinnet, og dermed øke sannsynligheten for vellykket målretting av mutagenese til den ønskede locus. Dessuten kan de homologe regionene som driver rekombinasjon være meget omfattende, noe som ytterligere bidrar til en effektiv målrettet homolog rekombinasjon.

Protocol

MERK: Den eksperimentelle strategi for målrettet in situ histone genet mutagenese omfatter flere trinn (oppsummert i figur 1). Disse trinnene omfatter: (1) erstatning av målet histon-genet med URA3-genet, (2) Produksjon og rensing av PCR-produkter som tilsvarer to delvis overlappende fragmenter av målet histon-genet ved bruk av primere som bærer den ønskede mutasjon (er), (3- ) Fusion PCR av de to delvis overlappende fragmenter for å oppnå full størrelse PCR-produkter for integ…

Representative Results

Vi beskriver generering av en hht2 allel som uttrykker en histon H3 mutant protein huse et bytte i posisjon 53 fra en arginin til en glutaminsyre (H3-R53E mutant) som et representativt eksempel på målrettet in situ mutagenese strategi. Vi ga en stamme hvor hele ORF av HHT2 erstattes med URA3-genet (se trinn 1 av protokollen). Denne belastningen, yAAD156, havner også en his3Δ200 …

Discussion

Den høye grad av sekvenshomologi mellom de to ikke-alleliske gener som koder for hver av de fire kjerne histonproteinene i haploide S. cerevisiae-celler kan representere en utfordring for forskere som ønsker å spesifikt mot en av de to gener for mutagenese. Tidligere beskrevet gjær mutageneseteknikker metoder, inkludert Delitto Perfetto, setespesifikk genomisk (SSG) mutagenese, og kloning-fri PCR-baserte allelet erstatning metoder ^{5, 6,</sup…}

Materials

1 kb DNA Ladder (DNA standards)	New England BioLabs	N3232L
Agarose	Sigma	A5093-100G
Boric Acid	Sigma	B0394-500G
dNTP mix (10 mM each)	ThermoFisher Scientific	R0192
EDTA solution (0.5M, pH 8.0)	AmericanBio	AB00502-01000
Ethanol (200 Proof)	Fisher Scientific	16-100-824
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma	E4884-500G
Lithium acetate dihydrate	Sigma	L6883-250G
MyCycler Thermal Cycler	BioRad	170-9703
Poly(ethylene glycol) (PEG)	Sigma	P3640-1KG
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (high fidelity DNA polymerase)  and 5X buffer	Fisher Scientific	50-443-960
Salmon sperm DNA solution	ThermoFisher Scientific	15632-011
Sigma 7-9 (Tris base, powder form)	Sigma	T1378-1KG
Sodium acetate trihydrate	Sigma	236500-500G
Supra Sieve GPG Agarose (low metling temperature agarose)	AmericanBio	AB00985-00100
Taq Polymerase and 10X Buffer	New England BioLabs	M0273X
Toothpicks	Fisher Scientific	S67859
Tris-HCl (1M, pH 8.0)	AmericanBio	AB14043-01000
a-D(+)-Glucose	Fisher Scientific	AC170080025	for yeast media
Agar	Fisher Scientific	DF0140-01-0	for yeast media
Peptone	Fisher Scientific	DF0118-07-2	for YPD medium
Yeast Extract	Fisher Scientific	DF0127-17-9	for YPD medium
4-aminobenzoic acid	Sigma	A9878-100G	for complete minimal dropout medium
Adenine	Sigma	A8626-100G	for complete minimal dropout medium
Glycine hydrochloride	Sigma	G2879-100G	for complete minimal dropout medium
L-Alanine	Sigma	A7627-100G	for complete minimal dropout medium
L-Arginine monohydrochloride	Sigma	A5131-100G	for complete minimal dropout medium
L-Asparagine monohydrate	Sigma	A8381-100G	for complete minimal dropout medium
L-Aspartic acid sodium salt monohydrate	Sigma	A6683-100G	for complete minimal dropout medium
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma	C7880-100G	for complete minimal dropout medium
L-Glutamic acid hydrochloride	Sigma	G2128-100G	for complete minimal dropout medium
L-Glutamine	Sigma	G3126-100G	for complete minimal dropout medium
L-Histidine monohydrochloride monohydrate	Sigma	H8125-100G	for complete minimal dropout medium
L-Isoleucine	Sigma	I2752-100G	for complete minimal dropout medium
L-Leucine	Sigma	L8000-100G	for complete minimal dropout medium
L-Lysine monohydrochloride	Sigma	L5626-100G	for complete minimal dropout medium
L-Methionine	Sigma	M9625-100G	for complete minimal dropout medium
L-Phenylalanine	Sigma	P2126-100G	for complete minimal dropout medium
L-Proline	Sigma	P0380-100G	for complete minimal dropout medium
L-Serine	Sigma	S4500-100G	for complete minimal dropout medium
L-Threonine	Sigma	T8625-100G	for complete minimal dropout medium
L-Tryptophan	Sigma	T0254-100G	for complete minimal dropout medium
L-Tyrosine	Sigma	T3754-100G	for complete minimal dropout medium
L-Valine	Sigma	V0500-100G	for complete minimal dropout medium
myo-Inositol	Sigma	I5125-100G	for complete minimal dropout medium
Uracil	Sigma	U0750-100G	for complete minimal dropout medium
Ammonium Sulfate	Fisher Scientific	A702-500	for complete minimal dropout medium
Yeast Nitrogen Base	Fisher Scientific	DF0919-07-3	for complete minimal dropout medium
5-Fluoroorotic acid (5-FOA)	AmericanBio	AB04067-00005	for  5-FOA medium