多能高效分化干细胞NKX6-1<sup> +</sup>胰腺祖
Summary
这里，我们描述一个4级协议分化人胚胎干细胞在体外 NKX6-1 +胰祖细胞。这个协议可以应用于各种人多能干细胞系的。
Abstract
多能干细胞具有自我更新和分化为多种谱系，使它们有吸引力的来源可用于研究和糖尿病的未来治疗胰腺祖细胞的产生的能力。本文概述旨在产生自人胚胎干细胞（胚胎干细胞）的胰腺祖细胞的四阶段分化方案。这个协议可以被应用到许多的人多能干细胞（HPSC）线。采取产生胰腺祖细胞的方法是区分人类胚胎干细胞胰腺发展的关键阶段精确建模。这开始于定形内胚层，这是由在活化素A，碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的和CHIR990210的存在下培养细胞来实现的诱导。进一步的分化和图案与成纤维细胞生长因子10（FGF10）和Dorsomorphin生成类似细胞后前肠。添加的雷廷伊斯兰会议组织酸，头蛋白，圣-1和FGF10区分后前肠细胞进入胰腺内胚层细胞的特性。最后，表皮生长因子（EGF）的结合，烟和头蛋白导致有效地产生PDX1 + / NKX6-1 +细胞。流式细胞仪进行，以确认特定的标志物的表达在胰腺发育的关键阶段。的PDX1 + / NKX6-1 +胰在阶段4的端祖细胞能够在移植后产生的成熟β细胞免疫缺陷小鼠的，并且可以进一步分化以产生在体外产生胰岛素的细胞。因此，有效地产生PDX1的+ / NKX6-1 +胰祖细胞，如在该协议证明的，是非常重要的，因为它提供了一个平台，以研究人类胰腺发育的体外和提供细胞的来源与分化为潜在可能EVβ细胞entually用于糖尿病的治疗。
Introduction
糖尿病的发病率正在增加，根据加拿大糖尿病协会，据估计超过11亿人在加拿大是糖尿病或糖尿病前期，与具有1型糖尿病（T1D）1这些个体的5-10％。 T1D]是由位于胰岛内产生胰岛素的β细胞的破坏引起的自身免疫性疾病。目前，生活在1型糖尿病人需要胰岛素2的外源性来源。尽管在胰岛素治疗的进展，患者1型糖尿病继续有困难的时候，他们的调节血糖水平，并继续遭受既低血糖症和高血糖。治疗的一个有前途的形式恢复正常血糖在T1D是利用人胚胎干细胞（胚胎干细胞），其可以用来产生胰岛素生产在体内和体外 3β细胞的无限供给的， <s向上类=“外部参照”> 4，5，6，7。分化的胚胎干细胞对β细胞样细胞可以使它可能研究糖尿病体外 ，允许新的治疗靶点的鉴定2型糖尿病，并提供用于移植细胞分化为T1D患者。
在从体外人类胚胎干细胞产生胰岛素生产细胞的最成功的尝试是概括胰腺发育4,5期间发生的胚胎的事件。这涉及到不同的信号传导途径的操纵到显影胰腺的关键阶段准确建模。胰腺发育开始于定形内胚层，其特点是CXCR4和CD117（C-KIT）8，9的表达的诱导。 definit的精确调节IVE内胚层组织是所必需的肠道管，其然后经历前 – 至 – 后和腹侧背侧图案的形成。背侧和腹侧胰芽来自表达胰腺十二指肠同源框基因（Pdx1的 ），这是必要的胰腺发育10的后前肠的区域出现。背，腹芽融合形成胰腺，然后经历了广泛的上皮细胞重建和扩建11。承诺内分泌和外分泌谱系伴随表达多能祖细胞（多用途储值卡）的产生，除其他外，转录因子Pdx1的，NKX6.1和Ptf1a 12,13。多用途储值卡，将成为内分泌和导管细胞继续表达Nkx6-1同时降低Ptf1a表达。与此相反，外分泌谱系细胞会失去expressioNkx6-1的n和维护Ptf1a表达12。
转录因子Nkx6-1在胰腺发育关键作用，特别是在内分泌祖细胞对β细胞的分化。如前所述胰腺发育14中，缺失Nkx6-1导致形成β细胞受损。因此，产生在体外和体内产生胰岛素的β细胞，需要Nkx6-1的有效诱导。
我们最近开发的协议，有效地生成从hPSCs PDX1 + / NKX6-1 +胰腺祖细胞。这些HPSC衍生胰腺祖细胞生成移植后成熟β细胞免疫缺陷小鼠3。该分化方案可以分为4个阶段的特点：1）定形内胚层诱导，2）后前肠图案，3）胰说明书和4）NKX6-1诱导。在这里，我们提供的定向分化的每个步骤的详细描述。
Protocol
Representative Results
Discussion
成功地从hPSCs 在体外产生NKX6-1 +胰腺祖依赖于使用hPSCs高品质的文化和定向分化涉及胰腺发育过程中的关键管理发展阶段的特定信号通路的精确调节的。虽然该协议可以用于诱导在各种HPSC线NKX6-1稳健表达如先前3所示，以确保有效的NKX6-1代以下考虑应。重要的是，所有的细胞培养和介质制剂在无菌环境中，以防止污染进行。重要的是，在胚胎干细胞集落已达到适当?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这手稿是由来自多伦多总与西方基金会和班廷和最佳糖尿病中心，大学健康网络研究生奖资金支持。
Materials
| Media and cytokines | |||
| 1-Thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | |
| Activin A | R&D | 338-AC/CF | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Buffer | BD Bioscience | 554722 | |
| BD Perm/Wash buffer, 1x | BD Bioscience | 554723 | |
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| CHIR990210 | Tocris | 4423a | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995 | |
| DNase I | VWR | 80510-412 | |
| Dorsomorphin | Sigma | P5499 | |
| EGF | R&D | 236-EG | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 88150 | |
| FGF10 | R&D | 345-FG | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Nicotinamide | Sigma | NO636 | |
| NOGGIN | R&D | 3344-NG | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875 | |
| SANT-1 | Tocris | 1974 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Life Technologies | 12605-010 | |
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Antibodies for flow cytometry (working dilutions) | |||
| CD117 PE (1:100) | Life Technologies | CD11705 | |
| CXCR4 APC (1:50) | BD Bioscience | 551966 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400) | Life Technologies | A-31571 | |
| Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 705-546-147 | |
| Isotype Control Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 015-000-003 | |
| Isotype Control Goat IgG | R&D | AB-108-C | |
| NKX6-1 (1:2000) | DSHB | F55A10 | |
| PDX1 (1:100) | R&D | AF2419 |
References
- Cogger, K., Nostro, M. C. Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes. Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2014).
- Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- D’Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Gouon-Evans, V., et al. BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm. Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).
- Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
- Pan, F. C., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).
- Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors. Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).
- Zhou, Q., et al. A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis. Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).
- Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
- Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. Retinoic acid stability in stem cell cultures. Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).
- Korytnikov, R., Nostro, M. C. Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells. Methods. , 56-64 (2016).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
- Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7 (5), e37004 (2012).
