Протоколы для генерации HPSC мутантные линии, используя платформу iCRISPR и дифференцировать hPSCs в глюкозу реагирующих бета-клеток, как описано. Объединение генома технологии редактирования с HPSC-направленной дифференцировки обеспечивает мощную платформу для систематического анализа роли линиджа детерминант в развитии человека и прогрессирования заболевания.
Допрос функции гена в самообновляющихся или дифференциации человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) предлагает ценную платформу к пониманию развития людских ресурсов и рассечения механизмов болезни в блюдо. Для того, чтобы извлечь выгоду из этого потенциального применения требует эффективных инструментов генома редактирования для создания HPSC мутантов в связанных с заболеванием генов, а также в пробирке протоколы дифференцировки HPSC вызывать заболевание релевантных типов клеток , которые тесно резюмировать их аналоги в естественных условиях. Эффективная платформа генома для редактирования hPSCs имени iCRISPR был разработан через Talen-опосредованной нацеливания экспрессионной кассеты cas9 в локус AAVS1. Здесь, протоколы для генерации индуцируемых линий cas9 HPSC с использованием клеток, культивированных в химически определенной среде и загрузочным устройством, свободных от состояния описаны. Подробные процедуры с использованием системы iCRISPR для гена нокаута или точных генетических изменений в hPSCs, либо через пна гомологичные конец присоединения (NHEJ) или с помощью точных нуклеотидных изменений с использованием шаблона гомологии направленного ремонта (HDR), соответственно, включены. Эти процедуры включают в себя технические описания конструкции, продукции и трансфекцию CRISPR направляющих РНК (gRNAs); измерение частоты мутаций CRISPR по T7E1 или ПДРФ анализов; а также создание и проверка клоновых мутантных линий. Наконец, мы летописные процедуры HPSC дифференциации в глюкозу реагирующих панкреатических бета-подобных клеток, имитируя в естественных условиях эмбрионального развития поджелудочной железы. Сочетание технологии iCRISPR с направленной HPSC дифференциации позволяет систематическое исследование функции гена, чтобы углубить наше понимание механизмов развития панкреатических и заболевания диабетом.
Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) обладают способностью и самообновлению и дают начало всем производные трех эмбриональных зародышевых линий. Они обеспечивают ценный ресурс для заместительной клеточной терапии и моделирования заболевания, выступая в качестве уникальной платформы резюмировать клеточные процессы в человеческом контексте развития. Они также являются источником экспериментальных клеток для масштабируемых анализа с высокой пропускной способностью. Тем не менее, прогресс был ограничен из-за двух основных проблем: отсутствие эффективных инструментов генетической модификации и трудности в обобщал сложных эмбриональные стадии развития в культуре блюдо.
Генетическая модификация является незаменимым инструментом для изучения функции генов в нормальном развитии и болезни. Тем не менее, в то время как классический ген ориентации подходов путем гомологичной рекомбинации оказались мощным инструментом для рассекают функции генов в эмбриональных стволовых клетках мышей (mESCs) 1, этот подходбыл крайне неэффективным при применении к hPSCs 2, 3. Недавно бодрый присоединение программируемых, сайт-специфических нуклеаз от природы до лабораторного использования, в том числе цинка палец нуклеаз (ZFNs), активатора транскрипции, как эффекторных нуклеаз (Таленс) и кластерные регулярно interspaced коротких палиндромных повторов (CRISPR) / CRISPR-ассоциированных (КАС) системы 4, означает , что генной инженерии стала гораздо более легкой задачей , в широком диапазоне организмов и клеточных линий, в том числе в hPSCs. Эти редактирования гена инструменты использовать в своих интересах тот факт, что химерные нуклеазы, такие как эндонуклеазы cas9 может разрешить целый ряд генетических модификаций путем индукции двунитевых разрывов (DSBs) на точных местах, вызывая эндогенной репарации ДНК машины, чтобы активировать либо негомологичный конец присоединения (NHEJ) или гомологии направленного ремонта (HDR). Оба механизма могут быть использованы для генетических манипуляций путем индукции eithэр случайная вставка и удаление мутации (вставки подсчитывали ; через NHEJ), для создания сдвига рамки мутации , которые сводят на нет аллелей гена, или точные нуклеотидные замены (через HDR), резюмировать мутации пациента , для моделирования заболеваний человека или исправить болезнетворный мутации для генной терапии ,
CRISPR / Cas-опосредованной генной инженерии необходимы два компонента: постоянная РНК наведением cas9 эндонуклеазы, необходимую для расщепления ДНК и РНК переменной CRISPR (crRNA) и транс-активационного (tracrRNA) дуплекса, который определяет признание целевой ДНК. CrRNA / tracrRNA дуплекс может быть заменен одной химерного направляющей РНК (gRNA), которые были найдены более эффективно 5, 6, 7 работать. В то время как система CRISPR / cas9 была адаптирована к большинству экспериментальных организмов и клеточных линий, доставки и экспрессии cas9 и gRNA значительно варьируется и должна быть дополнительно оптимизирована для ACHIНакануне редактирования эффективный геном во многих системах, в том числе hPSCs 8. Эффективный геном-редактирования платформы, iCRISPR, была создана в hPSCs 5. В этой системе Talen-опосредованной подход был использован целевой как аллели "трансген безопасной гавани локуса" AAVS1 в транс, один аллель с обратным тетрациклиновой управлением трансактиватора (M2rtTA) , а другой с элементом ответа тетрациклин (TRE ) вождения выражение cas9 (iCas9) в hPSCs. В установленных клоновых линиях (iCas9 hPSCs), cas9 высоко экспрессируется с лечением доксициклина. В то же время, из-за своего небольшого размера (100 нт), одиночные или множественные gRNAs могут быть легко доставлены в iCas9 hPSCs с высокой эффективностью и может направить cas9 для расщепления по конкретным участкам, обеспечивая эффективную NHEJ-опосредованного нарушения гена, а также HDR-опосредованной точные нуклеотидные модификации в присутствии коротких одноцепочечной ДНК (оцДНК) шаблонов доноров. Система iCRISPR может бытьиспользуется , чтобы успешно генерировать панель заболевания имитирующие линий HPSC с биаллельных (гомозиготным или гетерозиготным соединение) или гетерозиготных с потерей функции мутаций в важных генов развития 5, 9. В то время как число групп сообщали эффективного редактирования гена с использованием CRISPR / Условный hPSCs, успех остается ограниченным небольшим числом технологически развитыми лабораторий. Платформа iCRISPR предлагает эффективное еще простое решение для обычного редактирования генов исследователями различных уровней квалификации, и он уже использовался в ряде опубликованных исследований нашей группой и другими 9, 10, 11, 12. Этот подход также был продлен до индуцируемого глушителей на основе экспрессии dCas9-KRAB 13.
Наряду с прогрессом в геном редактирования технотысяч-, значительные улучшения были также достигнуты в обеспечении HPSC и направленной дифференцировки. Условия культивирования для hPSCs эволюционировали от облученного мышиных эмбриональных фибробластов (КПКО) фидерной зависит фидерными свободных условий на определенных компонентов внеклеточного матрикса, а также от сложных композиций средств для химически определенных условиях среды 14. Такие улучшения уменьшили изменчивость hPSCs вследствие партии к партии различий в КПКО подготовка и Нокаут сывороточных компонентов замены, и, таким образом, обеспечивают более воспроизводимую среду для HPSC дифференциации. В то же время, расширение знаний о путях передачи сигналов , регулирующих эмбриональное развитие человека, а также открытия с высокой пропускной способностью скринингов лекарственных средств, привели к улучшению дифференцировки протоколов 15, 16, 17, 18. Эти протоколы более тесно имитировать в Львовео стадии развития и генерируют типы клеток , которые тесно резюмировать их аналоги в естественных условиях. Для HPSC дифференцировки в поджелудочной линии, первоначальные протоколы передразнил раннего развития поджелудочной железы относительно хорошо, но в конце концов, генерируемый polyhormonal бета-клеток, которые были незрелых плода фенотипов и откликнулся плохо к глюкозе стимуляции. Последние достижения 16, 17, 19, 20 позволили для выработки глюкозы реагировать панкреатических бета-подобных клеток, что позволит нам исследовать более поздние события, такие как формирование и дальнейшее созревание monohormonal бета – клеток.
Здесь мы подробно применение генома-модифицированных линий для изучения развития поджелудочной железы путем комбинирования системы iCRISPR с HPSC на основе экстракорпорального дифференциации платформы по отношению к глюкозе реагирующих pancreatic бета-подобные клетки. Такое соединение мощных инструментов для редактирования генома с улучшенным протоколом HPSC дифференцировки предлагает не только скорость и масштаб , необходимый для удовлетворения растущего спроса на проверки причинно – следственной связи заболевания, но также позволяет сложные генетические манипуляции для дальнейших механистической расследования транскрипционный контроль , лежащие в основе нормального развития и болезни 9 ,
Время Соображения для генерации мутантных линий
Хотя в последнее время подходы, основанные на CRISPR / Cas систем для редактирования генома привели к успешному прицеливания, более эффективной и универсальной платформой была бы предпочтительнее для более масштабных анализов функции генов. Платформа iCRISPR предлагает быстрый и эффективный способ введения мутаций в любой интерес гена 5, 9. Во-первых, ПЦР на основе метода синтеза gRNA позволяет производить сотни gRNAs в формате выстроил в один день без затрат времени стадий клонирования. Во-вторых, с доксициклин-индуцируемой экспрессии cas9 в iCas9 hPSCs стадию с участием gRNA трансфекцию требует лишь минимальное количество работы, и, таким образом, многократный gRNA таргетингом эксперименты могут проводиться одновременно. В-третьих, в связи с высокой адресности эффективности, достигаемые с помощью нашей системы, анализ ~ 24 – 48 колоний на gRNA трансфицированных должно быть Suffциент устанавливать несколько моноаллельную и биаллельной мутантных линий для одного гена, хотя эффективность варьируются в зависимости от локуса-мишени. Так как это возможно для подготовленных индивидуальных механически отбора 384 колоний (4 х 96-луночные планшеты) на одном заседании, который должен занять ~ 4 часа под микроскопом рассекает, обученный человек может быть как ожидается, генерировать мутантные линии, влияющие на 12 генов в 12 месяцев. Обтекаемый поколение HPSC мутантов в течение короткого времени позволяет проводить систематический анализ массива факторов транскрипции и / или компонентов сигнального пути , которые взаимодействуют друг с другом, регулируя процесс развития 9. Кроме того, эффективный мультиплексированный ген нацеливание также открывает дверь к исследованию генетических взаимодействий лежащих в основе сложных человеческих черт.
Генерация точных генетических изменений
Вывод конкретного пациента ИПСК из легко доступных соматического типа клеток s и дифференциация в болезни соответствующих типов клеток обеспечивают большую возможность для функциональной проверки связанных с заболеванием мутаций. Тем не менее, из-за значительной изменчивости генетического фона между отдельными лицами, прямое сравнение ИПСК от пациентов и здоровых доноров может не позволяют отличить фенотипов болезнь от фоновых эффектов. Поэтому необходимо сформировать изогенных ИПСК управления путем коррекции мутации болезни назад к последовательности дикого типа или ввести мутации конкретного пациента в HPSC фоне дикого типа, как это было предложено другими 25, 26. В дополнение к пропадание функции (NULL) мутаций, можно теперь более точно проанализируем механизмы болезней с помощью введения изменений последовательности конкретного пациента в эндогенного локуса в hPSCs, включая гиперморфный, гипоморфными, neomorphic или доминантно-негативного пациента мутации.
ntent "> Точная генетическая модификация использует HDR для ремонта DSB в присутствии шаблона ремонта. Так как он намного менее эффективен, чем NHEJ-опосредованного репарации ДНК, донор плазмиду, содержащую пациента-специфической мутации, кассета выбора лекарственного средства, а также плечами гомологии ранее использовалась в качестве шаблона ремонта 2. После выбора лекарственного средства и проверки мутации конкретного пациента, второй этап , как правило , требуется для извлечения кассеты выбора лекарственного средства. в то время как наиболее широко используемые системы Cre-LoxP и FLP-FRT оставить позади остаточное последовательность в эндогенном локусе, использование PiggyBac транспозону позволило бесшовной удаления кассеты выбор препарата 27. в последнее время , короткие шаблоны оцДНК также было показано , чтобы поддерживать эффективное HDR с конструированными эндонуклеаз 28 ДНК. по сравнению с плазмидой – донора , оцДНК может быть непосредственно синтезирован и, таким образом, обходит трудоемким этапом клонирования. При этом он имеет бытьен показали, что, по со-трансфекцию gRNA и шаблон оцДНК для индукции гомологии направленного ремонта, iCRISPR могут быть использованы для введения конкретных нуклеотидные модификации с высокой эффективностью. Это очень важно для не только рассекает роль основных нуклеотидов внутри белковых функциональных доменов, но и для моделирования мутации человеческих болезней и потенциально исправления этих ассоциированной с заболеванием мутации для терапевтического вмешательства. Из-за большого количества восприимчивости локусов, каждый из которых связан с несколькими вариантами последовательности, моделирования сложных и мультигенной заболеваний, таких как сахарный диабет является проблемой для генетиков. В качестве платформы iCRISPR носит разрешительный характер для быстрой генерации серии аллельного или multiplexable гена прицеливания, он может облегчить исследование множественной ассоциированной с заболеванием локусов, либо по отдельности, либо в сочетании с изогенных фоном.Ориентация на повышение эффективности и Off-целевые эффекты
У нас есть обнаружили хорошую корреляцию между T7E1 и результатов анализа ПДРФ и числа мутантных линий, определенных с помощью секвенирования. Это подчеркивает важность выполнения этих анализов параллельно с созданием клоновых линий. В то время как нацеливающие эффективность достигаемые может варьироваться в зависимости от геномных локусов, в большинстве одного гена-нацеливание экспериментов, 20 – 60% клонов были обнаружены оба аллеля мутировали ( в том числе и в рамке считывания и мутации) со сдвигом рамки 9. В тех случаях , когда был выполнен мультиплексированный ген нацеливание, тройные биаллельных мутантные клоны с 5-10% эффективности были получены 5. оцДНК-опосредованной HDR из нескольких генов были выполнены также для получения точных генетических изменений, с эффективностью получения гомозиготными забивные клонов в пределах от 1 – 10% 5. Работа с CRISPR / Cas в hPSCs, любые мутации в потенциальных местах вне цели, которые не разделяют ту же gRNA целевую последовательность еще предстоит обнаружитьдеваха = "Xref"> 5, 9, 12. Секвенирование всего генома проводили в недавнем исследовании также не выявили существенных вне целевых мутаций в клоновых линиях HPSC генерируется с использованием CRISPR / Cas 29. Тем не менее, чтобы свести к минимуму потенциальный эффект путая фенотипы, введенные мутации в офф-целевых сайтов эффекта, предполагается генерировать независимые мутантные линии с использованием по меньшей мере двух независимых gRNAs, ориентированных на различные последовательности в пределах одного гена. Подобные фенотипы, наблюдаемые в нескольких строках генерироваться с использованием различных gRNAs может принципиально исключить возможность, что фенотип приходит из вне целевого эффекта.
Feeder-зависимых по сравнению с независимой культуры и таргетинга
Традиционные методы HPSC культуры включают их техническое обслуживание и расширение на фидерных клеток в средах, содержащих сыворотку или замены сыворотки, которая включает животных Проддукты, такие как бычий сывороточный альбумин. Питающие клетки, сыворотка, сыворотка замены, и альбумин содержат сложные, неопределенные компоненты и показать значительную изменчивость партии. Адаптация к кормушке, химически заданное состояние значительно сокращает усилия для поддержания HPSC и, что более важно, повышает согласованность дифференциации экспериментов. В настоящее время существует очень мало исследований , которые описывают процедуры редактирования генома на hPSCs культивировали в полностью определенных условиях культивирования 30. Мы обнаружили высокую эффективность CRISPR таргетирования при gRNA трансфекция и клоновая осаждение проводили в фидерных свободных условиях по сравнению с фидерными зависящих от условий культивирования. Мы считаем, что это связано с увеличением выживаемости клеток после трансфекции и одноклеточного высева для образования колоний. Кроме того, клетки-фидеры было показано ранее для секвестрации реагентов трансфекции, тем самым снижая эффективность трансфекции.
ОбъединениеГеном Редактирование с помощью направленной дифференцировки
Предыдущие протоколы дифференцировки дали лишь небольшую часть инсулина-позитивных клеток, большинство из которых были polyhormonal и напоминали эмбриональные эндокринных клеток 23. Недавний прогресс позволил дифференцировать hPSCs в более зрелых глюкозы реагировать бета-клеток , как 16, 17, 19, 20. Мы можем обычно получить , по меньшей мере , 75% однозначных эндодермы клетки, 40% Pdx1 + Nkx6.1 + панкреатические клетки – предшественники, и около 20% Nkx6.1 + CPEP + глюкоза реагирующих бета-подобные клетки , используя HUES8 hPSCs 9. В сочетании с системой редактирования генома iCRISPR, это более надежный протокол дифференциации способствовал анализ факторов транскрипции, которые имеют решающее значение для панкреатических предшественниках и эндокринных стадиях дифференцировки поджелудочной железы. Это сделаетВозможно, в будущих исследованиях, чтобы изучить большое количество генов – кандидатов заболевания для функциональной проверки и расследования в механизмах, лежащих в основе сахарного диабета 9.
Будущие приложения или направления
Наша система iCRISPR может способствовать генерации более сложных геномных модификаций, таких как создание репортер аллели через HDR-опосредованного генного таргетинга с использованием ДНК – матриц , длиной донорские кодирующего белок метки или флуоресцентные репортеров 12. Мы показали , что, из – за высокой CRISPR ориентации эффективность достигается в системе, этот процесс может быть выполнен в hPSCs, без необходимости выбора дополнительно наркотиков 12. Кроме того, мультиплексированный ген ориентации может быть использован для исследования генетических взаимодействий основной комплекс болезни человека, как это показано в нашем недавнем исследовании, которое по нашему мнению , является первым примером такой работы 31. ICRИСПИ также могут быть использованы для понимания ген-регул торный контроль путем создания делеции либо в некодирующих РНК или в гене регуляторных областей, таких как промоторы и энхансеры. Для того, чтобы эффективно генерировать регуляторных мутантов с использованием iCRISPR, gRNAs могут быть разработаны, чтобы сорвать сайт связывания белка, ДНК-связывающим, в том числе, но не ограничиваясь базального транскрипционного аппарата или тканесецифического фактора транскрипции. оцДНК шаблон опосредованную HDR также могут быть использованы для мутировать специфический белок-связывающие сайты. Наконец, мы предполагаем , что дальнейшая оптимизация позволит использовать платформу iCRISPR в hPSCs для более высокой пропускной способности генетического анализа плюрипотентности фенотипов или фенотипы заболевания , когда в сочетании с экстракорпорального протоколом дифференцировки в. Эти iCRISPR-опосредованного исследования могут позволить для более быстрой идентификации кандидатов, ассоциированных с заболеваниями генов и изучение их функциональной значимости.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была частично финансируется NIH / NIDDK (R01DK096239) и штата Нью-Йорк стволовой клетки наук (NYSTEM C029156). ZZ была поддержана NYSTEM докторантуру из Центра биологии стволовых клеток из Sloan Kettering института.
Chemically defined medium (E8) | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Essential 8 basal medium and Essential 8 supplement included |
Truncated recombinant human form of vitronectin | Thermo Fisher Scientific | A14700 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | |
Dissociation reagent (TrypLE Select enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563029 | 1X, animal origin free, recombinant enzyme |
G418 Sulfate | Thermo Fisher Scientific | 10131035 | Geneticin Selective Antibiotic |
Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P8833 | Puromycin Selective Antibiotic |
DNA Polymerase (Herculase II Fusion) | Agilent Technologies | 600679 | PCR kit |
MEGAshortscript T7 Transcription kit | Thermo Fisher Scientific | AM1354 | |
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1908 | |
Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
Opti-MEM medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | Reduced Serum Medium |
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778150 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit | QIAGEN | 69504 | Genomic DNA extraction kit |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
MCDB 131 medium | Thermo Fisher Scientific | 10372-019 | |
BLAR medium | Thermo Fisher Scientific | Custom-made with a published formulation (Rezania et al., 2014) | |
L-glutamine supplement (GlutaMAX) | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
NaHCO3 | Thermo Fisher Scientific | 144-55-8 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
BSA | LAMPIRE Biological Laboratories | 7500855 | Fatty acid free |
GDF8 | PeproTech | 120-00 | |
CHIR-99021 | Stemgent | 04-0004 | GSK-3 inhibitor |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Vitamin C |
FGF7 | R&D Systems | 251-KG | |
SANT1 | Tocris Bioscience | 1974 | Hedgehog inhibitor |
RA | Sigma-Aldrich | R2625 | Retinoic acid |
LDN | Stemgent | 04-0019 | BMP inhibitor |
IWP-2 | Tocris Bioscience | 3533 | Wnt antagonist |
ITS-X | Thermo Fisher Scientific | 51500-056 | |
TPB | EMD Millipore | 565740-1MG | PKC activator |
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T6397 | |
ALK5i II | Enzo Life Sciences | ALX-270-445 | ALK5 inhibitor II |
ZnSO4 | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
GSiXX | EMD Millipore | 565789 | Gamma secretase inhibitor XX, NOTCH signaling inhibitor |
N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Trolox | EMD Millipore | 648471 | Vitamin E analogue |
R428 | Selleck Chemicals | S2841 | AXL receptor tyrosine kinase inhibitor |
24mm Transwell with insert | Corning Life Sciences | 3414 | |
Gene Pulser Xcell Electroporation System | Bio-Rad | 1652660 | |
0.4 cm Electroporation Cuvettes | Bio-Rad | 1652081 | |
AAVS1-TALEN-L | Addgene | 59025 | |
AAVS1-TALEN-R | Addgene | 59026 | |
AAVS1-Neo-M2rtTA | Addgene | 60843 | |
AAVS1-Puro-iCas9 | Addgene | 58409 | |
T7 Endonuclease I | NEB | M0302L | |
Buffer 2 | NEB | B7002S | NEBuffer 2 |
Long oligonucleotide | Eton Bioscience or IDT | ||
SOX17 antibody | R&D Systems | AF1924 | 1: 500 |
FOXA2 antibody | Millipore | 07-633 | 1: 100 |
CXCR4-APC antibody | R&D Systems | FAB170A | 1: 25 |
PDX1 antibody | R&D Systems | AF2419 | 1: 500 |
NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12 | 1: 500 |
NKX2.2 antibody | DSHB | 74.5A5 | 1: 100 |
NEUROD1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1084 | 1: 100 |
Insulin antibody | Dako | A0564 | 1: 2000 |
C-peptide antibody | DSHB | GN-ID4-c | 1: 2000 |
Glucagon antibody | Sigma-Aldrich | G2654 | 1: 1000 |