Detta dokument beskriver ett förfarande för mätning alloreaktivitet i en blandad population av T-celler med användning av avbildning flödescytometri.
Mätningen av immunologiska reaktivitet mot donatorantigener i transplanterade patienter kommer sannolikt att vara avgörande för en framgångsrik minskning eller indragning av immunosuppression. Den blandade leukocytreaktion (MLR), begränsande spädningsanalyser, och trans-vivo fördröjd överkänslighet (DTH) assay alla har tillämpats på denna fråga, men dessa metoder har begränsad prediktiv förmåga och / eller betydande praktiska begränsningar som minskar deras användbarhet. Imaging flödescytometri är en teknik som kombinerar de multiparametrisk kvantitativa befogenheter flödescytometri med avbildningsfunktioner av fluorescensmikroskopi. Vi nyligen använt sig av en avbildnings flödescytometri tillvägagångssätt för att definiera andelen mottagande T-celler med förmåga att bilda mogna immun synapser med donatorantigenpresenterande celler (APC). Med användning av en väl karakteriserad mus hjärttransplantat-modellen, har vi visat att frekvensen av in vitro immun synapser bland T-APC Membrane kontakthändelser förutspådde kraftigt allograft utfall avslag, tolerans och en situation där transplantation överlevnad är beroende av inducerade regulatoriska T-celler. Frekvensen av T-APC kontakter ökade med T-celler från möss under akut avstötning och minskas med T-celler från möss utförda svarar mot alloantigen. Tillsatsen av regulatoriska T-celler i systemet in vitro minskas förlängda T-APC kontakter. Kritiskt, var denna effekt ses också med humant polyklonalt expanderad, naturligt förekommande regulatoriska T-celler, vilka är kända för att kontrollera avstötning av mänskliga vävnader i humaniserade musmodeller. Vidareutveckling av denna metod kan möjliggöra en djupare karakterisering av alloreaktiva T-cellavdelningen i transplantatmottagare. I framtiden kan ytterligare utveckling och utvärdering av denna metod använder mänskliga celler utgör grunden för analyser används för att välja patienter för immunosuppression minimering, och det kan användas för att mäta effekterna av tolerogenic terapier i kliniken.
Solid organtransplantation har förändrat vården av patienter med gravt sjukdomar i njure, lever, hjärta och lungor. På grund av skillnader i större och mindre histokompatibilitetsantigener dock allografter omgående avvisas av mottagande T-celler om immunosuppressiva läkemedel inte används. Dessa medel har många negativa effekter, inklusive risken för cancer och organdysfunktion. En stor klinisk mål är därför att minska dosen av immunosuppression till den miniminivå som krävs för att förhindra allograftavstötning. Denna nivå kommer sannolikt att variera beroende på graden av aktivering av det medfödda immunsystemet; graden av givare och mottagare alloantigen mismatch; och mellan patienter skillnader i immunförsvar, farmakokinetik och farmakodynamik.
Tyvärr har transplantations kliniker inte har några verktyg för att noggrant utvärdera donator reaktivitet i enskilda patienter 1. den blandadeleukocytreaktion (MLR) kan detektera donator reaktivitet, men den misslyckas med att tillförlitligt förutsäga transplantat utfall 2, 3. Begränsande utspädningsanalyser, cytokinreceptorer ELISPOTs och det trans vivo analys antingen mäta ett begränsat område av svar eller är inte praktiskt 4, 5, 6, 7, 8 .Gene uttryck profiler har avslöjat signaturer relaterade till operativ tolerans 9, 10, 11, 12 och avvisande 13, 14, 15, men dessa är inte alltid generaliserbart över populationer 16 och kan i slutänden har begränsad användbarhet i enskilda patienter. Sekvensbaserad Analyses av T-cellreceptor (TCR) av T-celler i det perifera blodet 17 eller prolifererande i MLR 18 har också utvecklats, men kräver ytterligare validering.
Begreppsmässigt skulle det vara önskvärt att ha en analys som detekterar de tidigaste nödvändiga stegen i mottagaren T-cellaktivering av ett donatorantigen. Eftersom odling av celler över dagar (som i MLR) kan introducera artefakter, skulle ett sådant test idealt inte kräva mätning av nedströms händelser, såsom proliferation eller effektorfunktion. Lika, skulle det emellertid också vara önskvärt för testet att vara beroende av någon form av T-cellfunktion, eftersom rent beskrivande bedömningar (T ex TCR sekvense) kan vara oförmögen att skilja mellan anerga och funktionella T-celler.
Talrika studier har visat att långvarig T-APC kontakt krävs för bildandet av ett immun synaps, vilket är ett nödvändigt förstasteg i T-cellsvaret 19, 20, 21, 22. Vi rapporterade nyligen att, under dynamisk i tidsförloppet vitro avbildning, cirka 5 – 10% av mus-CD4 + T-celler bildar långvariga kontakter med allogen benmärgshärledda dendritiska celler (BMDCs) 23. Frekvensen av långvarig kontakt ökades i djur som avvisade en graft, medan i möss som tidigare göres toleranta mot samma antigener, förblev det vid nivåer som ses i untransplanted möss 23. Långvarig interaktioner reducerades i närvaro av mottagaren tregs och ökade i deras frånvaro, och vi observerade liknande fenomen med användning av humana T-celler och allogena monocyt-härledda DCs (MoDCs) 23.
Men uppräkning av långa kontakter inom en polyklonal T-cells population är tidsödande och arbetsintensivt. Vi gjorde därför användning av avbildning flödescytometri för att undersöka allogen immun synaps bildning. Imaging flödes inkorporerar cytometry de multiparametrisk datainsamlings och analysmöjligheter av konventionell flödescytometri med de encelliga avbildnings förmågor av fluorescensmikroskopi. Denna teknik har använts av andra forskare för att studera immun synaps bildning av monoklonala T-celler 24, 26, 27 eller i närvaro av superantigener 28. I sådana inställningar, emellertid varierar frekvensen av svarande T-celler från 30-100%, medan alloreaktiva T-celler är i allmänhet uppskattas representera 5-15% av den totala T-cellrepertoaren 29, 30, 31, 32. Viktigt visade vi att bild flödescytometri kan producera AVery jämförbart mått på alloreaktiva T-cellfrekvens 23 och att ändringar i synapsen frekvens inom en polyklonal T-cellpopulationen är prediktiva för transplantat utfall 23. För närvarande har denna metod har optimerats för att mäta direkt alloreaktivitet av CD4 + T-celler, men i princip kan det också utvecklas för att undersöka CD8 + T-celler och indirekt väg. Indirekt alloreaktivitet tros bli allt viktigare vid längre tider efter transplantation 33. Vi håller på att utveckla denna metod för att använda mänskliga celler, som gör det möjligt för att testa patienter. Sålunda, i framtiden, kan den övergripande strategin vara användbara för den funktionella utvärderingen av T-cellsvar i transplantatmottagare före transplantation; omedelbart efter transplantation; och på lång sikt, när läkemedel minimering blir ett viktigt mål.
Imaging flödescytometri har använts för att demonstrera immun synaps bildning mellan monoklonala T-celler och APC eller i närvaro av superantigener 24, 25, 26, 27, 28. Denna metod drar fördel av det faktum att efter en produktiv T-cell-APC-kontakt, omordnar T-cellen dess aktincytoskelettet, polarisera den mot kontaktstället 21. Denna omlagring inträffar inte utan TCR-signalering, och det är därför en tidig korrelat av T-cellaktivering 19, 20, 21. Den metod som presenteras här anpassar detta tillvägagångssätt för mätning av alloreaktiva T-cellfrekvens i polyklonala T-cellpopulationer. Som sådan kan det i framtiden att ligga till grund för utvecklingen av analyser för givar reactivi ty vid klinisk transplantation.
Även direkta jämförelser har ännu inte gjorts, verkar detektion av alloreaktiva immun synapser ha överlägsen prognosförmåga än den konventionella MLR. Till exempel, har tidigare arbete visat att, i det toleransinducerande protokoll som beskrivs ovan, resultaten av en MLR misslyckas med att på ett tillförlitligt sätt korrelerar med transplantat utfall 2.
Ett antal analyser har utvecklats för drifts tolerant tillstånd hos människor 9, 10, 11, även om dessa inte mäter effektor cellfunktion som svar på alloantigen. I kontrast, IFNy ELISPOT-analyser 8 åtgärd effektor-T-cellfunktion, men kan inte fånga hela spektrumet av cytokinutsöndring som kan vara relevanta för akut och kronisk allograftavstötning, såsom IL-17 38,> 39. Den begränsande spädningsanalys 4, vilket är arbetskrävande, och det trans vivo-analys 6, vilket kräver möss, har betydande praktiska begränsningar som skulle hindra deras tillämpning i en klinisk miljö. Senaste förbättringarna på analys av prolifererande celler med användning av TCR-sekvensanalys av T-celler som svarade i MLR kan vara av värde, men liksom analysen presenteras här, kommer att kräva ytterligare validering i kliniska studier 18, 40.
Vidareutveckling av immun synapsen detektionsanalysen kommer att kräva att ett antal viktiga frågor besvaras. Först analysen som utvecklade mäter endast direkt alloreaktivitet. Den direkta vägen involverar presentationen av allogena MHC / peptidkomplex på givarhärledda APC. Den senare är i allmänhet elimineras snabbt efter transplantation, och vidare alloantigen presentation är carried ut genom mottagande APC presenter intakt donator MHC (halv direkt väg) eller bearbetade donator antigener på själv-MHC (indirekt väg). Den indirekta vägen är en viktig drivkraft för kronisk allograftavstötning 33, 41.
I princip bör det vara möjligt att detektera indirekta immun synapser användning av denna analys, men indirekt alloreaktiva T-celler har en mycket lägre frekvens än direkt 42, 43, vilket innebär att analys av ett större antal händelser kommer att krävas. Ett andra övervägande är att vi bara har testat denna analys med användning av CD4 + T-celler, medan CD8 + T-celler är också en viktig komponent i den antidonatorsvar. Återigen bör det vara möjligt att detektera CD8 + T-cell-APC-synapser som använder denna metod. En annan begränsning är att metoden kräver manuell granskning och analys av cellbilder i slut MembRane kontakt gate, och vi arbetar för närvarande på automatisering av detta steg.
Slutligen kräver metoden testning och utveckling i mänskliga försökspersoner, och preliminära studier med humana prover för närvarande genomförs. Ytterligare fenotypiska T-celldelmängdsanalys (dvs effektor, minne, reglerande, etc.) i kombination med detektionen av immun synapser i transplantatmottagare skulle representera ett kraftfullt tillvägagångssätt för att karakterisera alloreaktiva T-cellrepertoaren och kommer att vara en viktig fokus för framtida arbete.
The authors have nothing to disclose.
SCJ stöddes av en International Society for Heart and Lung Transplantation Research Fellowship och Royal College of Physicians och kirurger i Kanada Detweiler resa Fellowship.SM stöddes delvis av en International Society for Heart and Lung Transplantation Career Development Award (till SCJ). SS stöddes av National Institutes of Health Research Oxford Biomedical Research Centre.JH är mottagare av en njure Research UK Senior Non-Clinical gemenskap. Detta arbete har finansierats av följande bidrag till AB och KW: a Wellcome Trust Program Grant (082519Z07Z), en brittisk Heart Foundation Program Grant (PG / 10 / 62,28504) och EU: s ramprogram 7 (en studie, BioDRIM). Författarna vill tacka Michael Parsons och Flödescytometri Core Facility vid Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health System, Toronto för att ge tillgång till och stöd med ImageStream Mark X instrument.
Phosphate-buffered saline | Various | Varies | |
Ethylenediamenetetraacetic acid, 0.5M solution | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
Triton X-100 nonionic detergent | Sigma-Aldrich | X100 | |
Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | Solution is 37% formaldehyde and so must be diluted 25 times for 1.5% solution |
Cell strainers, 70 μm pore size | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
Phalloidin-fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P5282 | |
7-aminoactinomycin D | Thermo Fisher Scientific | A1310 | Reconstitute in DMSO |
Allophycocyanin-conjugated anti-mouse CD90.2 | eBioscience | 17-0902 | |
Pacific blue-conjugated anti-mouse CD11b | eBioscience | 48-0112 | Pacific blue has been replaced by eFluor 450 |
Biotinylated anti-mouse CD3 | eBioscience | 13-0032 | |
Biotinylated anti-mouse MHC class II | eBioscience | 13-5321 | |
Biotinylated anti-mouse B220 | eBioscience | 13-0452 | |
Biotinylated anti-mouse CD8 | eBioscience | 13-0081 | |
Biotinylated anti-mouse CD19 | eBioscience | 13-0193 | |
Anti-biotin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MidiMACS magnetic cell separator | MIltenyi Biotec | 130-042-302 | |
recombinant mouse GM-CSF | Peprotech | 315-03 | |
recombinant human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | Human TGFβ1 has activity on mouse cells |
Amnis ImageStream X Mark II | Amnis/EMD Millipore | N/A | Imaging flow cytometer; details available at http://www.emdmillipore.com/ |
IDEAS Software | Amnis/EMD Millipore | N/A | Free download (registration required): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20 |
Cell culture medium | Various | Varies | |
Fetal bovine serum | Various | Varies | |
Cell culture plates | Various | Varies |