Isolasjon og berikelse av lever stamfar Delsett identifisert av en roman overflaten markør Kombinasjon

Summary

Leverskade er ledsaget av stamcelleekspansjon som representerer en heterogen cellepopulasjon. Ny klassifisering av denne cellerommet gjør det mulig å skille av flere undergrupper. Metoden som beskrives her illustrerer strømningscytometri-analyse og med høy renhet isolasjon av ulike undergrupper som kan brukes for videre analyser.

Abstract

I løpet av kroniske leverskader, stamceller ekspandere i en prosess som kalles ductular reaksjon, noe som også medfører forekomsten av inflammatoriske cellulære infiltrat og epitelial celleaktivering. Den stamcelle befolkningen under slike betennelsesreaksjoner har hovedsakelig blitt undersøkt ved hjelp av enkle overflatemarkører, enten ved histologisk analyse eller ved flowcytometri-baserte teknikker. Men nye overflatemarkører identifisert ulike funksjonelt distinkte undergrupper innenfor leveren stamfar / stamcellerommet. Metoden som presenteres her beskriver isolering og detaljert flyt cytometri analyse av progenitor undergrupper ved hjelp av ny overflatemarkør kombinasjoner. Videre viser det hvordan de ulike stamcelle undergrupper kan isoleres med høy renhet ved hjelp av automatisert magnetisk og FACS sortering-baserte metoder. Viktigere, ny og forenklet enzymatisk dissosiasjon av leveren gjør det mulig for isolering av disse sjeldne cellepopulasjoner med en høy levedyktighetsom er overlegen i forhold til andre eksisterende metoder. Dette er spesielt aktuelt for ytterligere å studere stamceller in vitro, eller for isolering av høy kvalitet RNA for å analysere genekspresjon profilen.

Introduction

Leveren regenerering er hovedsakelig knyttet til selvfornyelse kapasitet på hepatocytter. Ikke desto mindre forekommer kroniske leverskader med stamcelle aktivering og ekspansjon, som er blitt forbundet med deres evne til å differensiere til hepatocytter og cholangiocytes ^{1, 2, 3, 4.} Dette er spesielt relevant fordi, i løpet av kroniske skader, er hepatocytter spredning ikke er effektive. Til tross for flere genetiske Tracing studier rettet mot stamceller, deres rolle i leveren regenerering er fortsatt kontroversielt ^{5, 6, 7, 8.} Videre har aktiveringen av progenitorceller vært knyttet til økt fibrotisk reaksjon i leveren, noe som stiller spørsmål om deres eksakte rolle under skader ⁹, ^10.

Den heterogene natur av stamcelle kammeret har lenge vært foreslått av genuttrykkstudier det isolerte progenitor-celler som uttrykker et enkelt overflatemarkør ved hjelp av mikrodisseksjon eller cellesortering-baserte metoder ^{1, 11.} Faktisk nylig en ny overflate markør kombinasjon hjelp gp38 (podoplanin) utvetydig knyttes tidligere enkeltmarkører stamceller til ulike undergrupper ^12. Viktigere, disse undergrupper ikke bare skilte seg i deres overflate markør uttrykk, men også utstilt funksjonelle endringer i løpet av skader ^12.

Flere dyremodeller er blitt benyttet for å undersøke progenitor-celleaktivering og leveren regenerering. Det virker som de ulike skadetyper fremme aktivering av ulike undergrupper av stamceller ^12. Dette kan forklare phenotypic divergens av ductular reaksjon er observert hos mennesker ^4. Dermed komplekse fenotypiske og funksjonelle analyser av stamceller er avgjørende for å forstå sin rolle i skader og den sanne betydningen av ductular reaksjon i leversykdommer.

Foruten overflate markør kombinasjoner, de avgjørende forskjeller i celle isolasjon protokoller ytterligere komplisere konklusjonene basert på tidligere studier ^2. En betydelig mengde av studier rettet rollen til stamceller som i stor grad har forskjellig isolasjonsprotokoll (f.eks lever dissosiasjon (enzymkombinasjon og varigheten av prosessen), tetthet medium og sentrifugehastighet) ^2. En optimalisert isolert teknikk, noe som gir bedre levedyktighet for sjeldne celle populasjoner og reflekterende av undergruppe sammensetning, har blitt utviklet og utgitt nylig ^12. Målet med denne artikkelen er å gi en mer Fondetfeilte protokoll fra denne levercelleisoleringsprosedyren og den undergruppe analyse for å tillate riktig gjengivelse av teknikken. I tillegg omfatter protokoll en sammenligning med den tidligere isolasjonsmetoden for å vise forskjellene i forhold til den nye protokoll.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer ble gjennomført med godkjenning av etikk og dyr omsorg komiteer av Homburg University Medical Center. 1. Utarbeidelse av materialer og buffere Fersk forberede alle buffere som kreves for leveren fordøyelse ved hjelp av sterile komponenter og en laminær hette for å unngå bakteriell forurensning. Forbered oppsamlingsbufferen (CB) ved å blande 49,5 ml RPMI-medium og 0,5 ml føtalt bovint serum (FBS; lav endotoksin, varme-inaktivert) for…

Representative Results

Fremgangsmåten presentert her for fordøyelsen av leveren ved anvendelse av en ny blanding av enzymer resulterer i en enkeltcellesuspensjon inneholdende parenchymale og ikke-parenchymale leverceller (figur 1 og 2a). Når ACK-lysering av røde blodlegemer, den direkte flowcytometri analyse av enkeltcellesuspensjonen er mulig (figur 1 og 2). Den gating strategien innebærer utelukkelse av dubletter og døde celler <strong…

Discussion

Leverbetennelse og skader av ulik opprinnelse utløse regenerative prosesser i leveren som er ledsaget av stamcelleekspansjon og aktivering ^{to, tre.} Disse lever stamceller har stamcelleegenskaper og sannsynligvis spille en betydelig rolle i pathomechanism av ulike leversykdommer.

Heterogeniteten av lever progenitorceller har lenge vært foreslått. Den revurdering av lever progenitor undergrupper ved hjelp av en ny overflate markør …

Materials

RPMI	Life Technologies	21875-034
phenol red free DMEM	Life Technologies	31053-028
FBS	Life Technologies	10270-106
Collagenase P	Sigma-Aldrich	11249002001
DNAse-I	Sigma-Aldrich	10104159001
Dispase	Life Technologies	17105041
ACK Lysing Buffer	Life Technologies	A10492-01
HBSS	Life Technologies	14025-050
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002	Prepare 1 % stock solution
10 % BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376
autoMACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	add 0.5 % (v/v) BSA and store on ice
Phenol-red free DMEM	Sigma-Aldrich	D1145
counting Beads Count Bright	Life Technologies	C36950
PI	Miltenyi Biotec	130-093-233
FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130-092-575
anti-CD31 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-097-418
anti-CD45 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-052-301
Dead Cell Removal Kit	Miltenyi Biotec	130-090-101
anti-Biotin MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-485
CD64 Purified	BioLegend	139302	Dilution: 1:100
CD16/32 Purified	BioLegend	101302	Dilution: 1:100
CD45 APC/Cy7	BioLegend	103116	Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells
CD31 Biotin	BioLegend	102504	Dilution: 1:200, marks endothelial cells
ASGPR1 Purified	Bio-Techne	AF2755-SP	Dilution: 1:100, marks hepatocytes
Podoplanin APC	BioLegend	127410	Dilution: 1:1400, marks progenior cells
Podoplanin Biotin	BioLegend	127404	Dilution: 1:1400
CD133 PE	Miltenyi Biotec	130-102-210	use 3 µl, marks progenitor cells
CD133 Biotin	BioLegend	141206	Dilution: 1:100
CD34 Biotin	eBioScience	13-0341-81	Dilution: 1:100
CD90.2 Pacific Blue	BioLegend	140306	Dilution: 1:800
CD157 PE	BioLegend	140203	Dilution: 1:600
EpCAM Brilliant Violet 421	BioLegend	118225	Dilution: 1:100
Sca-1 Biotin	Miltenyi Biotec	130-101-885	use 10 µl
Mouse IgG2b, κ PE	BioLegend	400311
Rat IgG1 PE	BioLegend	400407
Rat IgG2b, κ APC/Cy7	BioLegend	400624
Rat IgG2a, κ Biotin	BioLegend	400504
Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421	BioLegend	400535
Syrian Hamster IgG APC	BioLegend	402012
Syrian Hamster IgG Biotin	BioLegend	402004
Normal Goat IgG Control Purified	Bio-Techne	AB-108-C
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A11055	Dilution: 1:800
Streptavidin Alexa Fluor 405	Life Technologies	S32351	Dilution: 1:400
100 µm Filter mesh	A. Hartenstein	PAS3
LS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACS separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
MACSQuant Analyzer 10	Miltenyi Biotec	130-096-343
AutoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec	130-092-545
FACS AriaTMIII	BD Biosciences
FACSDiva sofware	BD Biosciences
Polypropylene Round bottom tube	Falcon	352063
Rneasy plus mini kit	Qiagen	74134	RLT lysis buffer is included