Tillverkning av Tredimensionell Pappersbaserade Mikrofluidikanordningar för Immun

Summary

Vi detalj en metod för att tillverka tredimensionella pappersbaserade mikrofluidanordningar för användning i utvecklingen av immunanalyser. Vårt förhållningssätt till sammansatta enheten är en typ av flerskikts, additiv tillverkning. Vi visar en sandwich immun att tillhandahålla representativa resultat för dessa typer av pappersbaserade enheter.

Abstract

Papper vekar vätskor självständigt på grund av kapillärkraften. Genom mönstring papper med hydrofoba barriärer kan transporten av vätskor styras och riktas inom ett skikt av papper. Dessutom stapla flera skikt av mönstrat papper skapar sofistikerade tredimensionella mikroflödes nätverk som kan stödja utvecklingen av analytiska och bioanalytiska analyserna. Pappersbaserade mikrofluidikanordningar är billiga, bärbara, lätta att använda, och kräver ingen extern utrustning för att fungera. Som ett resultat håller de mycket lovande som en plattform för point-of-care diagnostik. För att kunna utvärdera användbarheten och analytiska prestanda pappersbaserade enheter måste lämpliga metoder utvecklas för att säkerställa deras tillverkning är reproducerbar och på en skala som är lämplig för laboratoriemiljö. I detta manuskript, till ett förfarande fabricera en allmän anordning arkitektur som kan användas för pappersbaserade immunanalyser beskrivs. Vi använder en form av additiv tillverkar byg (multi-layer laminering) för att framställa anordningar som innefattar flera skikt av mönstrat papper och mönstrat lim. Förutom att påvisa en korrekt användning av dessa tredimensionella pappersbaserade mikroflödessystem enheter med en immunanalys för humant koriongonadotropin (hCG) är fel i tillverkningsprocessen som kan resultera i enhets misslyckanden diskuteras. Vi förväntar oss att detta sätt att tillverka pappersbaserade enheter kommer att finna bred användbarhet i utvecklingen av analytiska applikationer som utformats speciellt för inställningar begränsad resurs.

Introduction

Papper är allmänt tillgänglig i en rad olika formuleringar eller kvaliteter, kan funktionaliseras för att ställa sina egenskaper, och kan transportera vätskor självständigt genom kapillärverkan eller uppsugning. Om papperet är mönstrad med en hydrofob substans (t.ex. fotoresist ^en eller vax ^2), uppsugning av vätskor kan styras rums inom ett skikt av papper. Till exempel kan en pålagd vattenhaltigt prov riktas in i ett antal olika zoner för att reagera med kemiska och biokemiska reagenser lagrade i papperet. Dessa pappersbaserade mikroflödessystem enheter har visat sig vara en användbar plattform för utveckling av bärbara och billiga analytiska analyser ^{3, 4, 5, 6, 7.} Tillämpningar av pappersbaserade mikroflödessystem enheter inkluderar point-of-care diagnostikef "> 8, övervakning av miljöföroreningar ^9, upptäckt av förfalskade läkemedel ^10, och delokaliserad hälso- och sjukvård (eller" telemedicin ") i begränsad resurs inställningar ^11.

Flera lager av mönstrat papper kan sättas samman till en integrerad enhet där hydrofila zoner från grannskikten (dvs över eller under) ansluter för att bilda kontinuerliga fluid nätverk vars inlopp och utlopp kan vara kopplade eller vänster oberoende. ¹² Varje skikt kan innefatta ett unikt mönster, som möjliggör den rumsliga separation av reagens och multipla analyser som skall utföras på en enda anordning. Den resulterande tredimensionella mikroflödessystem enhet är inte bara kan uppsugning vätskor för att möjliggöra analytiska analyser (t.ex. leverfunktionstester ¹³ och elektrokemisk detektering av små molekyler ^14), men det kan också support ett antal sofistikerade funktioner (t.ex. ventilerna ¹⁵ och enkla maskiner ¹⁶⁾ som är gemensamma för de traditionella mikroflödes metoder. Viktigt, eftersom papper transporterar vätskor genom kapillärverkan, dessa enheter kan drivas med minimal ansträngning från användaren.

Eftersom reagens kan lagras i den tredimensionella strukturen för en pappersbaserad enhet, kan komplexa protokoll reduceras till en enda tillsats av vattenhaltigt prov till en enhet. Nyligen införde vi en generell tredimensionell enhet arkitektur som kan användas för att utveckla pappersbaserade immun använder vax-tryckteknik för att skapa mönstrade skikt. ^{17, 18} Dessa studier fokuserade på hur aspekter i samband med utformningen av enhets antal staplade lager används, sammansättningen av lagren, och mönstret av den tredimensionella mikroflödesnätverks kontrollerade totalt perprestanda av immunanalysen. I slutändan kunde vi använda dessa konstruktionsregler för att underlätta en snabb utveckling av en multiplex immun ^19. I detta manuskript, en tidigare utvecklat immun för humant koriongonadotropin (hCG, graviditetshormon) är ¹⁷ som ett exempel för att illustrera de strategier som vi har utvecklat för montering och tillverkning av tredimensionella pappersbaserade immun. Följaktligen fokuserar vi på montering och drift av en anordning i stället för utveckling av en analys.

I en sandwich-immunanalys, vilket är det format som används för att detektera hCG, en infångningsantikropp som är specifik för en subenhet av hormonet beläggs på ett fast substrat, som därefter blockeras för att begränsa icke-specifik adsorption av ett prov eller efter en efterföljande reagens. Detta substrat är oftast en polystyren-mikrobrunnsplatta (t.ex. för en enzymkopplad immunabsorberande analys eller ELISA). Provet är sedansattes till en brunn och fick inkubera under en tidsperiod. Efter noggrann tvättning, är en antikropp specifik för den andra subenheten av hCG sattes och fick inkubera. Denna detekteringsantikroppen kan konjugeras till en kolloidal partikel, ett enzym, eller fluorofor i syfte att producera en mätbar signal. Brunnen åter tvättas före tolkningen av resultaten av en analys (t.ex., med användning av en plattläsare). Medan kommersiella kit förlita sig på denna tidsödande flerstegsprocess, kan alla dessa steg utföras snabbt i pappersbaserade mikroflödessystem enheter med minimal inblandning av användaren.

Den anordning som används för hCG immun består av sex aktiva skikt, som är, från topp till botten, som används för provtillsats, konjugat lagring, inkubation, fånga, tvätt, och blot (Figur 1). Provet Dessutom lagret består av kvalitativt filterpapper. Den underlättar införandet av ett vätskeprov och skyddar reagenserna i konjugatet layer från föroreningar från omgivningen eller oavsiktlig beröring av användaren. Konjugatet skiktet (kvalitativt filterpapper) håller färgproducerande reagens (t.ex. kolloidalt guld-märkt antikropp) för immunanalys. Inkubationen skiktet (kvalitativt filtrerpapper) tillåter provet att resa sig i sidled inom planet av papperet för att främja bindning av analyten med reagens innan den når nästa lager, infångningsskiktet. Infångningsskiktet (nylonmembran) innehåller ligander specifika för analyten adsorberas till materialet. Efter analysen är slutförd, är detta skikt avslöjade att möjliggöra visualisering av det färdiga immunokomplex. Tvättskiktet (kvalitativt filterpapper) drar överflödig vätska inklusive gratis konjugerade reagens bort från ansiktet av infångningsskiktet i blot skiktet (tjock kromatografi papper). Den sex-skiktet enheten hålls samman av fem skikt av mönstrat, dubbelsidig självhäftande: fyra skikt av permanent självhäftande upprätthålla integriteten i den monblödde enhet och ett skikt av borttagbart lim underlättar skalar av enheten för att inspektera resultatet av immun på infångningsskiktet.

Vid tillämpningen av detta manuskript, använder vi bara negativa och positiva kontrollprover av hCG (0 mIU / ml och 81 mIU / ml, respektive) för att ge representativa resultat av ett pappersbaserat immun, som tillåter en särskild diskussion om förhållandet mellan tillverkningsmetoder och prestandan hos en enhet. Förutom att visa hur man tillverkar enheter framgångsrikt markerar vi flera tillverkningsfel som kan leda till fel på en enhet eller reproducerbara analysresultat. Protokollet och diskussion som beskrivs i detta manuskript ger forskarna värdefull insikt i hur pappersbaserade immun är utformade och tillverkade. Medan vi fokuserar vår demonstration på immun, räknar vi med att de riktlinjer som presenteras häri kommer att vara i stort sett användbar för tillverkning av trednella pappersbaserade mikrofluidikanordningar.

Protocol

1. Beredning av pappersbaserade mikroflödessystem enhet Lager Förbered mönster för lager av papper, nylon, och lim med hjälp av en grafisk design program. 6 Varje skikt kan ha ett annat mönster. OBS: Mönstret kan innefatta inriktnings hål som inte krävs för en fungerande pappersbaserad immun, men hjälpa till med reproducerbar tillverkning av tredimensionella enheter. Placering av dessa hål kommer att skilja sig om enheter monteras individuellt, i remsor eller som hel…

Representative Results

Erhålla reproducerbara analys föreställningar tredimensionella pappersbaserade mikroflödessystem enheter förlitar sig på en tillverkningsmetod som säkerställer överensstämmelse mellan enheter. Mot detta mål, har vi identifierat ett antal tillverkningsprocesser och material överväganden och diskutera dem här i samband med att visa en pappersbaserad immunanalys. Vi använder ett vax tryckmetod för att bilda hydrofoba barriärer inom pappersbaserade mikrofluidikanordningar <s…

Discussion

Identifiera en reproducerbar tillverkningsstrategi är en viktig del av analysutveckling. ²² Vi använder en sekventiell, skikt-för-skikt tillvägagångssätt för tillverkning av tredimensionella pappersbaserade mikrofluidikanordningar. I motsats till de metoder som gäller fällbara eller origami tekniker för att producera flerskikts enheter från ett enda pappersark ^23, erbjuder ²⁴ additiv tillverkning en rad fördelar: (i) Flera mat…

Materials

Illustrator CC	Adobe		to design patterns for layers of paper and adhesive
Xerox ColorQube 8580 printer	Amazon	B00R92C9DI	to print wax patterns onto layers of paper and Nylon
Isotemp General Purpose Heating and Drying Oven	Fisher Scientific	15-103-0509	to melt wax into paper
Artograph LightTracer	Amazon	B000KNHRH6	to assist with alignment of layers
Apache AL13P laminator	Amazon	B00AXHSZU2	to laminate layers together
Graphtec CE6000 Cutting Plotter	Graphtec America	CE6000-40	to pattern adhesive films
Swingline paper cutter	Amazon	B0006VNY4C	to cut paper or devices
Epson Perfection V500 photo scanner	Amazon	B000VG4AY0	to scan images of readout layer
economy plier-action hole punch	McMaster-Carr	3488A9	to remove alignment holes
Whatman chromatogrpahy paper, Grade 4	Sigma Aldrich	WHA1004917
Fisherbrand chromatography paper (thick)	Fisher Scientific	05-714-4	to function as blot layer
Immunodyne ABC (0.45 µm pore size )	Pall Corporation	NBCHI3R	to function as material for capture layer
removable/permanent adhesive-double faced liner	FLEXcon	DF021621	to facilitate peeling
permanent adhesive-double faced liner	FLEXcon	DF051521
wax liner	FLEXcon	FLEXMARK 80 D/F PFW LINER	to assist with patterning adhesive
acrylic sheet	McMaster-Carr	8560K266	to fabricate frame
self-adhesive sheets	Fellowes	CRC52215	to use as protective slip
absolute ethanol	VWR	89125-172	to sanitize work area
bovine serum albumin	AMRESCO	0332
Sekisui Diagnostics OSOM hCG Urine Controls	Fisher Scientific	22-071-066	to use as positive and negative samples
anti-β-hCG monoclonal antibody colloidal gold conjugate (clone 1)	Arista Biologicals	CGBCG-0701	to treat conjugate layer
goat anti-α-hCG antibody	Arista Biologicals	ABACG-0500	to treat capture layer
10X phosphate buffered saline	Fisher Scientific	BP3991
Oxoid skim milk powder	Thermo Scientific	OXLP0031B
Tween 20	AMRESCO	M147