Måling og Ændre Parring Drive i Male<em> Drosophila melanogaster</em

Summary

Denne artikel beskriver en adfærdsmæssig analyse der bruger mandlige parring drev i Drosophila melanogaste r at studere motivation. Ved hjælp af denne metode, kan forskerne udnytte avancerede flyve neurogenetic teknikker til at afdække de genetiske, molekylære og cellulære mekanismer der ligger til grund denne motivation.

Abstract

Trods årtiers efterforskning, de neuronale og molekylære grundlag for motiverende stater forbliver mystisk. Vi har for nylig udviklet en ny, reduktionistisk og skalerbare system til dybtgående undersøgelse af motivation ved hjælp af parring drevet af mandlige Drosophila melanogaster (Drosophila), de metoder, som vi detaljer her. Den adfærdsmæssige paradigme centre på den konstatering, at mandlige parring drev falder sammen fertiliteten i løbet af gentagne parringer og genopretter løbet ~ 3 d. I dette system, de kraftfulde neurogenetic værktøjer til rådighed i fluen konvergerer med den genetiske tilgængelighed og formodede ledningsdiagram til rådighed for seksuel adfærd. Denne konvergens muliggør hurtig isolation og forhør af små neuronale populationer med specifikke motiverende funktioner. Here We detalje projektering og udførelse af mæthed assay, der bruges til at måle og ændre frieri motivation i den mandlige flue. Brug af denneassay viser vi også, at lave mandlige parring drev kan overvindes ved at stimulere dopaminerge neuroner. Den mæthedsfornemmelse analysen er enkel og billig, og robust til påvirkninger af genetisk baggrund. Vi forventer, at mæthed assay til at generere mange nye indsigter i neurobiologi af motiverende stater.

Introduction

Arbejde i Drosophila har givet dybe og banebrydende indsigt i mange biologiske fænomener, herunder arten af genet ^1, principperne for fosterudvikling ^2, døgnrytmen ^3, samt udvikling og ledningsføring af nervesystemet ^{4, 5, 6.} Motivation er stadig langt mindre godt forstået end disse fænomener, måske på grund af de begrænsninger på de systemer, der er blevet undersøgt hidtil. Motivation i gylp primært undersøgt i forbindelse med sult, som rummer mange udfordringer på grund af deres forsvindende lille fødeindtagelse pr fodring Bout og exoskelet der udelukker åbenlyse tegn på fedtaflejring. Der er derfor et behov for at udvide de anvendte systemer til at studere motivation i gylp.

Vi beskriver en adfærdsmæssig ramme for studiet af parring drev iDrosophila. Dette system drager fordel af de neurogenetic værktøjer i gylp samt tilgængeligheden ^{7, 8, 9, 10, 11, 12} og den formodede connectome af sin seksuelt dimorfe kredsløb ^{8, 13.} Desuden er meget af den medfødte ^{14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21} og lærte ^{22, 23, 24} sensorisk-motorisk kredsløb kontrollerende frieri er udarbejdet i detaljer, hvilket giver en sjælden mulighedat finde den nøjagtige kredsløb node hvorpå motivation rammer. Vi har for nylig rapporteret, at i fluen, som hos mennesker, dopamin niveauer er centrale for parring drev ^{25, 26, 27.} Vi har fået genetisk adgang til den relevante dopamin-producerende og modtage neuroner i fluen, lette detaljerede molekylære mekanisme og kredsløb niveau analyser af denne bevaret fænomen ved hjælp af de analyser vi beskriver her ^25.

Vi tilføjer til de adfærdsmæssige analyser i Zhang et al. ²⁵ en ny flad adfærdsmæssige arena, der giver mulighed for video scoring, som vi kalder en 2-dimensional (2-D) mæthed assay, en vigtig forbedring i forhold til tidligere metoder. Følgelig den nye assay er mere skalerbar og målelig, og derfor mere egnet til genetiske skærme af gener og neuroner involveret i motivation. Vi bruger denne nye analyse, sammen med frieri assays og neurogetiske manipulationer, at vise, hvordan man kan måle og ændre parring drev i fluen.

Protocol

BEMÆRK: Denne protokol beskriver fremstillingen (§§ 1 – 3), udførelse (afsnit 4), og analyse (afsnit 4) 2-D mæthed analyser. Derefter bruger dopaminerg stimulation som et eksempel, afsnit 5 viser, hvordan man kan kombinere thermogenetic stimulation med 2-D mæthed assays til at fremkalde hyperseksualitet. Afsnit 6 beskriver 3 måder at kontrollere resultaterne af 2-D mæthed analyser. Endelig, afsnit 7 viser hvordan man kan måle inddrivelse af parring drev i mandlige fluer. 1. Bearbejdni…

Representative Results

For at karakterisere Drosophila parring drev, 3 dage gammel, WT Canton-S hanner blev testet i en 2-D mæthed assay. I løbet af assayet (4,5 timer), hanner parrer et gennemsnit på 4,8 ± 0,3 (middelværdi ± standardfejl på middelværdi, SEM) gange. Parringer indlede meste i de første 2 timer (78%) (figur 6a, 6b) og blive mindre hyppige som assayet skrider (figur 6A, 6B). Dette fald skyldes ikke mangel på parring partnere (74% kvinder forbli…

Discussion

Motiverende stater kan mæt, vedligeholdes, og genvundet ^34. Vi præsenterer en 2-D mæthed assay, der hurtigt og håndfast måler alle disse aspekter af parring drev i fluen. Dette assay åbner mulighed for at anvende avancerede flyve genetiske manipulationer for at studere de molekylære og kredsløbskomponenter i en motiveret adfærd.

Den mæthed analysen er afhængig af mandens evne til at retten og parre sig, og for at afslutte parringer på et passende tidspunkt…

Materials

1/16 inch clear acrylic	McMaster-Carr	8589K12	Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
1/8 inch clear acrylic	McMaster-Carr	8589K42	Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
3/16 inch clear acrylic	McMaster-Carr	8560K219	Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
1/32 inch black delrin	McMaster-Carr	8575K132	Used to make arenas; see Supplemental Material 1 for designs.
Hex screws, 1 inch long (50x)	McMaster-Carr	92314A115	Used to make arenas. Can be replaced by 3/4 inch screws (92314A113, McMaster-Carr) for 32-chamber arenas.
Thumb nuts (25x)	McMaster-Carr	92741A100	Used to make arenas. Can be replaced by regular hex nuts (90480A005, McMaster-Carr).
Camcorder	Canon	Vixia HF R700	Can be replaced by any consumer comcorder.