Dissekering av Larvernas Zebrafish gonadal Tissue
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för isolering av gonadal vävnad av larver zebrafisk, vilket kommer att underlätta undersökningar av zebrafisk könsdifferentiering och underhåll.
Abstract
Även vilda zebrafisk har en ZZ / ZW-systemet har domesticezebrafisk förlorat könskromosom. De utnyttjar en polygen könsbestämning system där flera gener fördelade över hela genomet kollektivt bestämma kön identiteter enskilda fiskar. För närvarande är de gener som är involverade i regleringen av gonad utveckling och hur de fungerar fortfarande svårfångade. Normalt isolera gonadal vävnad är det första steget för att undersöka köns utvecklingsprocesser. Här presenterar vi ett förfarande för att isolera gonadal vävnad från 17 dpf (dagar efter befruktning) och 25 dpf zebrafisk larver. Den isolerade gonadal vävnaden kan därefter undersökas genom morfologi och genuttryck profilering.
Introduction
Den stora kvinnliga köns avgörande i vilda zebrafisk kromosom 4 förloras eller ändras i den domesticerade zebrafisk (dvs vanliga lab stammar) 1. Istället har de en polygen könsbestämning system som åtföljs av miljöfaktorer såsom temperatur, hypoxi, tillgången till mat och befolkningstäthet. De detaljerade mekanismer för zebrafisk kön utveckling inte helt klarlagda. Grundläggande frågor som när zebrafisk könsbestämning inträffar, vad den primära könsbestämning signal (er) är / är, och vilka gener reglerar det första steget av gonad transformation återstår att besvaras 2, 3.
I processen för zebrafisk sex utveckling har flera viktiga steg erkänts. I tidigt skede av utvecklingen, med start från fyra HPF (timmar efter befruktning) primordiala könsceller (PGCs) undergår specifikation, migration till genitala åsen ochspridning. PGC nummer och ömsesidiga interaktioner mellan könsceller och somatiska celler är viktiga för gonad differentiering 4. Vid 13 dpf (dagar efter befruktning), könskörtlarna är i odifferentierade stadiet. Genom 17 dpf, könskörtlarna utvecklas till bi potential äggstockar i både framtida honor och hanar. Den apoptos-beroende övergång från äggstocken till testis börja vid 21 till 25 dpf och kan fortsätta under flera veckor. Med 35 dpf, har könet på gonad bestämts och könsspecifikt gametproduktion pågår i båda äggstockar och testiklar 5, 6, 7.
Hittills har olika kandidatgener och mekanismer för könsbestämning föreslagits. Proteomik och transcriptomic analys har isolerat många gener med sexuellt dimorphic uttryck och dessa gener har använts för att studera könsdifferentiering i zebrafisk 8, </sup> 9, 10. Till exempel, i larver zebrafisk, den cyp19a1a genen uttrycks specifikt i äggstocken men inte i testikeln 11, 12. Dessutom är AMH gen svagt uttryckt i äggstocks follikeln granulosaceller, men starkt i testikel Sertoliceller 13. Däremot är vasa gen kontinuerligt uttryckas i könscellerna hos både kvinnliga och manliga zebrafisk, vilket gör den till en lämplig gonad markör 14, 15.
Undersöker gonadala gen uttrycksnivåer är viktigt att förstå den molekylära mekanismen för könsbestämning och differentiering särskilt i bi-potentiell äggstock stadium 3, 9. Emellertid, den lilla storleken på larver zebrafisk och motsvarande små gonader komplicera isoleringen av gonadal vävnad för ytterligare molekylär analys. Tidigare studier användes dissekeras hela bålområdet mellan opercula och anal por 16. Denna beredning, även innehållande gonader, består av flera vävnader och organ. Alternativt kan transgena djur med gonad specifikt uttryck av GFP, såsom vasa: var EGFP används för gonadal vävnadsisolering via fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och laser capture micro-dissektion 17, 18. Men deras utbredd användning är begränsad. Här beskriver vi en enkel procedur för att isolera gonadal vävnad från larver zebrafisk vid 17 dpf och 25 dpf. Vi visar läget för könskörtlarna med avseende på andra organ och isolera morfologiskt intakta könskörtlarna från de omgivande vävnaderna. Vi visar vidare de gonad specifika gener såsom vasa och cyp19a1a är högt uttryckt i de isolerade gonader jämfört med stammen vävnad genom kvantitativ PCR (qPCR) -analys. Föreliggande protokoll möjliggör identifiering, isolering, RNA-rening och amplifiering av gonadala specifika gener från larver zebrafisk, vilket möjliggör efterföljande molekylär analys av gonadal vävnad 19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafisk har blivit en kraftfull modell och används flitigt inom utveckling och sjukdomsrelaterad forskning. Metoderna för isolering av organ i vuxna zebrafisk, såsom hjärna, hjärta, gonad, och njure, har dokumenterats väl 23, 24, 25. På grund av den lilla storleken och dynamisk omformning av de gonadala vävnaderna i larver zebrafisk, är isolering av gonadal vävnad en utmanande uppgift. Tidigare studier användes hel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar C Zhang för fisk vård. Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (31171074, 31371099 och 31571067 till GP) och av Pujiang Talent Project (09PJ1401900 till GP).
Materials
| Cell culture dish 100 mm | Corning | 430167 | For embryo incubation |
| 20 X EM | For a 1 liter needed: add 17.5 g NaCl, 0.75 g KCl and 2.9 g CaCl.2H2O; then add 0.41 g KH2PO4, 0.412 g Na2HPO4 anhydrous and 4.9 g MgSO4. 7H2O. | ||
| 1 X EM | Dilute 20 X EM in distilled water | ||
| AGAROSE G-10 | Gene | 121985 | For preparing the 2% agar plates |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | For RNA isolation |
| Meter glass | Shen Bo | 250 ml | For preparing the 2% agar plates |
| Microwave Oven | Midea | M1-211A | For heating the AGAR |
| TWEEZER DUMONT#5INOX | World Precision Instrument | 500341 | For dissection |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ168 | For dissection |
| Pure water equipment | Millipore | ||
| Ringer’s solution | For a 1 liter needed: Add 6.78g NaCl, 0.22 g KCl, 0.26 g CaCl2 and 1.19 g Hepes; then fill to 1 L; Adjust pH to 7.2. Sterilize by filtration and keep in an autoclaved clear polycarbonate container. | ||
| Transfer pipette | Samco | 202, 204 | |
| Metal bath | QiLinbeier | Model GL-150 | |
| Microscope | Leica | M205 FA | For photomicrograph |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micro Scale RNA Isolation Kit | Ambion | AM1931 | For RNA isolation from gonad tissues |
| Dnase I | Sigma | AMPD1-1KT | For DNA digestion in the RNA solution |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific | #K1631 | For first-strand cDNA synthesis |
| Rnase H | Thermo Scientific | #EN0202 | For digesting the residual RNA in the cDNA solution. |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | TOYOBO | QPK-201 | This product is a Taq DNA polymerase-based 2 x master mix for real-time PCR and applicable for intercalation assay with SYBR Green I. |
| Spectrophotometer | Ne Drop | OD-2000+ | Measuring the concentration of the total RNA |
| Mastercycler | Eppendorf | AG 22331 Hamburg | gene expression profiling |
References
- Wilson, C. A., et al. Wild sex in zebrafish: loss of the natural sex determinant in domesticated strains. 유전학. 198 (3), 1291-1308 (2014).
- Liew, W. C., Orban, L. Zebrafish sex: a complicated affair. Genomics. 13 (2), 172-187 (2014).
- Orban, L., Sreenivasan, R., Olsson, P. Long and winding roads: Testis differentiation in zebrafish. Mol. Cell. Endocrinol. 312 (1-2), 35-41 (2009).
- Blaser, H., et al. Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish. J. Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).
- Wang, X. G., Orban, L. Anti-Müllerian hormone and 11 β-hydroxylase show reciprocal expression to that of aromatase in the transforming gonad of zebrafish males. Dev. Dynam. 236 (5), 1329-1338 (2007).
- Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. Germ line control of female sex determination in zebrafish. Dev. Biol. 324 (2), 277-287 (2008).
- Uchida, D., Yamashita, M., Kitano, T., Iguchi, T. Oocyte apoptosis during the transition from ovary-like tissue to testes during sex differentiation of juvenile zebrafish. J. Exp. Biol. 205 (Pt 6), 711-718 (2002).
- Groh, K. J., Schönenberger, R., Eggen, R. I. L., Segner, H., Suter, M. J. F. Analysis of protein expression in zebrafish during gonad differentiation by targeted proteomics. Gen. Comp. Endocr. 193, 210-220 (2013).
- Siegfried, K. R. In search of determinants: gene expression during gonadal sex differentiation. J. Fish Biol. 76 (8), 1879-1902 (2010).
- Small, C. M., Carney, G. E., Mo, Q., Vannucci, M., Jones, A. G. A microarray analysis of sex- and gonad-biased gene expression in the zebrafish: evidence for masculinization of the transcriptome. BMC Genomics. 10, 579 (2009).
- Chiang, E. F., Yan, Y. L., Guiguen, Y., Postlethwait, J., Chung, B. Two Cyp19 (P450 aromatase) genes on duplicated zebrafish chromosomes are expressed in ovary or brain. Mol. Biol. Evol. 18 (4), 542-550 (2001).
- Kishida, M., Callard, G. V. Distinct cytochrome P450 aromatase isoforms in zebrafish (Danio rerio) brain and ovary are differentially programmed and estrogen regulated during early development. Endocrinology. 142 (2), 740-750 (2001).
- Rodríguez-Marí, A., et al. Characterization and expression pattern of zebrafish anti-Müllerian hormone (amh) relative to sox9a, sox9b, and cyp19a1a, during gonad development. Gene Expr.Patterns. 5 (5), 655-667 (2005).
- Krovel, A. V., Olsen, L. C. Expression of a vas::EGFP transgene in primordial germ cells of the zebrafish. Mech Dev. 116 (1-2), 141-150 (2002).
- Krovel, A. V., Olsen, L. C. Sexual dimorphic expression pattern of a splice variant of zebrafish vasa during gonadal development. Dev. Biol. 271 (1), 190-197 (2004).
- Tzung, K. W., et al. Early depletion of primordial germ cells in zebrafish promotes testis formation. Stem Cell Reports. 4 (1), 61-73 (2015).
- Hsiao, C., Tsai, H. Transgenic zebrafish with fluorescent germ cell: a useful tool to visualize germ cell proliferation and juvenile hermaphroditism in vivo. Dev. Biol. 262 (2), 313-323 (2003).
- Jorgensen, A., Nielsen, J. E., Morthorst, J. E., Bjerregaard, P., Leffers, H. Laser capture microdissection of gonads from juvenile zebrafish. Reprod Biol Endocrinol. 7, 97 (2009).
- Chen, S., Zhang, H., Wang, F., Zhang, W., Peng, G. nr0b1 (DAX1) mutation in zebrafish causes female-to-male sex reversal through abnormal gonadal proliferation and differentiation. Mol. Cell. Endocrinol. 433, 105-116 (2016).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Liew, W. C., et al. Polygenic sex determination system in zebrafish. PLoS One. 7 (4), e34397 (2012).
- Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis Exp. (37), (2010).
- Arnaout, R., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R. Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications. J. Vis Exp. (94), (2014).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis Exp. (54), (2011).
- Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124 (16), 3157-3165 (1997).
- Braat, A. K., Speksnijder, J. E., Zivkovic, D. Germ line development in fishes. Int. J. Dev. Biol. 43 (7), 745-760 (1999).
- Huang, H. Y., Ketting, R. F. Isolation of zebrafish gonads for RNA isolation. Methods Mol Biol. 1093, 183-194 (2014).
