تحديد البروتينات النباتية الجليد ملزمة من خلال تقييم تثبيط الآيس التبلور وعزل عن طريق الآيس تقارب تنقية
Summary
توضح هذه الورقة تحديد البروتينات ملزم الجليد من مصانع تجميد متسامح من خلال تقييم النشاط تثبيط الجليد التبلور والعزلة اللاحقة IBPs الأم باستخدام تنقية الجليد تقارب.
Abstract
بروتينات ملزمة الجليد (IBPs) تنتمي إلى عائلة من البروتينات التي يسببها الإجهاد التي يتم توليفها من قبل بعض الكائنات المعرضة لدرجات حرارة تحت الصفر. في النباتات، ويحدث الضرر تجميد عندما تنمو بلورات الثلج خارج الخلية، مما أدى إلى تمزق الأغشية البلازما واحتمال موت الخلايا. امتصاص IBPs إلى بلورات الثلج يقيد مزيد من النمو من خلال عملية تعرف باسم الجليد التبلور تثبيط (IRI)، مما يقلل من تلف الخلايا. أيضا إثبات IBPs القدرة على خفض درجة التجمد حل أقل من نقطة التوازن ذوبان، وهي خاصية تعرف باسم التباطؤ الحراري (TH) النشاط. وقد أثارت هذه خصائص وقائية الفائدة في تحديد IBPs جديدة نظرا لاحتمال استخدامها في التطبيقات الصناعية والطبية والزراعية. وتصف هذه الورقة تحديد مصنع IBPs من خلال 1) تحريض واستخراج IBPs في الأنسجة النباتية، 2) فحص مقتطفات للنشاط IRI، و3) العزلة وpurification من IBPs. بعد تحريض IBPs عن التعرض درجة حرارة منخفضة، ويتم اختبار مقتطفات للنشاط IRI باستخدام "تنبيه الفحص"، الذي يسمح للمراقبة نمو البلورات الجليدية باستخدام المجهر الضوئي العادي. هذا الاختبار يتطلب تركيز منخفض البروتين ويولد النتائج التي يتم الحصول عليها بسرعة وتفسيرها بسهولة، وتوفير شاشة الأولية للنشاط ملزم الجليد. IBPs ومن ثم يمكن عزلها عن تلويث البروتينات من خلال الاستفادة من خاصية IBPs إلى كثف على الجليد، من خلال تقنية تسمى "تنقية الجليد تقارب. استخدام لست] خلية تم جمعها من المستخلصات النباتية، أحد نصفي الكرة الأرضية الجليد يمكن أن تنمو ببطء على التحقيق النحاس. هذا يتضمن IBPs في البنية البلورية من الجليد الكريستالات. لا تتطلب معرفة البيوكيميائية أو الهيكلية مسبقة من نقابة المحامين، هذا الأسلوب يسمح للانتعاش من البروتين النشط. كسور البروتين المنقى الجليد يمكن استخدامها لتطبيقات المصب بما في ذلك تحديد الحماسيتسلسل المد التي كتبها الطيف الكتلي وتحليل الكيمياء الحيوية للبروتينات الأم.
Introduction
بروتينات ملزمة الجليد (IBPs) هي عائلة متنوعة من البروتينات الوقائية التي تم اكتشافها في عدد من الكائنات الحية بما فيها النباتات 1، 2 الحشرات والأسماك 3، والميكروبات 4. الميزة الرئيسية لهذه البروتينات هي قدرتها الفريدة على كثف تحديدا وكفاءة لبلورات الثلج، وتعديل نموها. IBPs ديك العديد من الخصائص موثقة، مع اثنين تتميز الأكثر رفاهية التباطؤ الحراري (TH) وتثبيط الجليد التبلور (IRI). لوحظ نشاط TH بسهولة أكبر في IBPs المنتجة في الحيوانات تجميد التعصب. نتائج هذا النشاط في خفض درجة التجمد من السوائل في الدورة الدموية أو الخلالي الكائنات الحية "لمنع التجمد. في المقابل، في الكائنات الحية تجميد متسامح، والتي سوف تجميد حتما في درجات حرارة تحت الصفر، IBPs يبدو أن النشاط TH منخفضة. وعلى الرغم من النشاط TH منخفض، وهو نشاط IRI عالية لتقييد صرخة الجليدوكثيرا ما لوحظ نمو ستال مع هذه البروتينات. بالنسبة للكائن الحي تجميد متسامح، وهذا النشاط IRI يساعد يفترض حماية الخلايا من النمو غير المنضبط من الجليد في مقصورات خارج الخلية.
على زر "فراش" نموذج يمكن استخدامها لوصف الآلية التي IBPs منع نمو بلورات الثلج 5. وبموجب هذا النموذج، IBPs كثف خصيصا لسطح الجليد الكريستال على فترات، مثل أن جزيئات الماء يمكن أن تتضمن فقط مع تنامي شعرية الكريستال الجليد في الفضاء بين IBPs المربوطة. وهذا يخلق انحناء الذي يجعل إدماج جزيئات الماء إضافية غير مواتية، وهو الحدث الذي يمكن وصف تأثير جيبس-تومسون 6. تقدم الراسية المياه مشبكة فرضية آلية لملزمة محددة من IBPs على سطح الجليد الكريستال حيث وجود بقايا اتهم المتمركزة على وجه التحديد على موقع بروتين ملزمة الجليد، والنتائج في ريوبأنهم يعتمدون على جزيئات الماء بحيث تتطابق مع واحد أو أكثر من الطائرات شعرية الكريستال الجليد 7.
النشاط TH يمكن كميا عن طريق قياس الفرق بين الذوبان وانخفاض درجات الحرارة من الكريستال الجليد واحد في وجود نقابة المحامين. في حين أن النشاط TH هي طريقة مقبولة على نطاق واسع لتقييم نشاط IBPs، فإن الفجوة TH المنخفضة التي تنتجها IBPs محطة (عادة سوى جزء صغير من درجة) عادة يتطلب تركيز نسبة عالية من البروتين، والمعدات المتخصصة والخبرة المشغل. وعلى الرغم من عدم IBPs-قد تحد من نمو البلورات الجليدية، بل هو ملكية مشتركة من قبل جميع IBPs وبالتالي اختبار للنشاط IRI وشاشة الأولية الفعالة لوجود IBPs، خصوصا بالنسبة لأولئك مع النشاط TH منخفضة. المنهجية المستخدمة لاختبار هذا النشاط يعرف باسم "فحص تنبيه"، حيث عينة البروتين فلاش تجميد لإنتاج أحادي الطبقة من بلورات الثلج الصغيرة، التي تمت ملاحظتها على مدى فترة من الوقت لتحديد ما إذا كانيقتصر نمو البلورات الجليدية. وخلافا للطرق الأخرى المستخدمة لفحص عينة الأنسجة مصدر لوجود IBPs، هذه التقنية قابلة للتطبيق لتركيزات بروتين منخفضة في حدود 10-100 نانوغرام، وتستخدم معدات يسهل ملفقة، ويولد البيانات التي يتم تفسيرها بسرعة وسهولة. ومع ذلك، فمن المهم التأكيد على أن هذا الفحص يوفر شاشة الأولية لIBPs التي ينبغي اتباعها من قبل تحديد TH وتشكيل الكريستال الجليد.
عزل البروتينات الأم يمثل تحديا، وغالبا ما تتطلب من المعلومات حول الخصائص التركيبية والكيميائية الحيوية للبروتين من الفائدة. تقارب من IBPs من أجل الايس يسمح لعزل هذه البروتينات باستخدام الثلج باعتبارها الركيزة لأغراض تنقية. منذ يتم دفع غالبية الجزيئات قبل الحدود، الماء المثلج أثناء نمو البلورات الجليدية، والنمو البطيء للجليد نصف الكرة في وجود نتائج العينة IBP في عينة درجة عالية من النقاء، خالية من الكميه كبيرالمنشأ من تلويث البروتينات والأملاح. وقد استخدم هذا الأسلوب لتحديد IBPs من الحشرات 8، 9، 10، 11 البكتيريا والأسماك والنباتات 12 13 و 14. بالإضافة إلى ذلك، الكسور المخصب IBP الذي تحقق من خلال هذه الطريقة يمكن أن تستخدم أيضا لتحليل الكيمياء الحيوية المصب. توضح هذه الورقة تحديد IBPs في النباتات من خلال الاستقراء واستخراج IBPs، وتحليل النشاط IRI للتأكد من وجود البروتينات، وعزل البروتينات باستخدام تنقية تقارب الجليد.
Protocol
Representative Results
Discussion
لتحليل ناجحة وتنقية IBPs، فمن المهم أن نفهم طبيعة حساسة للحرارة بعض هذه البروتينات. بعض النباتات IBPs تصبح غير مستقرة في درجات حرارة أعلى من 0 درجة مئوية، مما أدى إلى تتكشف، وهطول الأمطار وقلة النشاط. من أجل الحصول على IBPs النشطة، فمن الأهمية بمكان في كثير من الأحيان أن تتم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل منحة NSERC (كندا) إلى VKW.
Materials
| 1.5 mL microcentrifugetubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Adjustable lab jack | Fisher | S63080 | |
| Benchtop centrifuge | Desaga MC2 | ||
| Brass probe | Custom built | ||
| Camera/ camera port | Canon | Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port | |
| Cheesecloth | Purewipe/Fisher Scientific | 06-665-25A | |
| Concentration tubes (0.5 mL) | EMD Millipore | UFC501008 | |
| Concentration tubes (15 mL) | EMD Millipore | UFC900308 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher | AM12502 | |
| Cooling block | VWR | 13259 | Use a metal heating block |
| Dehumidifier | Whirlpool | 50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier | |
| Dessciation beads | t.h.e. Dessicant/VWR | EM-DX0017-2 | 6-8 mesh size; 100% indicating |
| Dissection microscope | Olympus Tokyo | ||
| Double walled glass bowl | Generic | Purchase from local lab glassware supplier | |
| Dry ice | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| EDTA-protease inhibitor tablets | Sigma Aldrich | 11836170001 | Roche cOmplete mini |
| Ethylene glycol | Generic | Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot) | |
| Hexane | Sigma Aldrich | 296090 | Anhydrous, 95%; hazardous |
| Immersion oil | Sigma Aldrich | 56822 | |
| JA10/20 centrifuge | Beckman | ||
| Large plastic petri dish | Generic | ||
| Liquid nitrogen | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| Magnetic stir plate | Hanna Instruments | HI190M | |
| Microscope cover slides | Fisher | 12-542A | |
| Plastic tube | Generic | Purchase PVC pipe from local hardware store | |
| Polarized film | Edmund Optics | 43-781 | |
| Polystyrene foam | Generic | Can be constructed from polystyrene shipping boxes | |
| Poreclain mortar and pestle | Fisher | FB961 | |
| PVPP | Sigma Aldrich | 77627 | 110 µm particle size |
| Retort Stand | Fisher | 12-000 | |
| Small stir bar | Fisher | 14-513-51 | |
| Temperature-programmable water bath | VWR | 13271-118 | |
| Vacuum grease | Dow Corning/Sigma Aldrich | Z273554 | |
| Vinyl tubing | Generic |
References
- Sidebottom, C., et al. Heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256 (2000).
- Duman, J. G. Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods. Annu Rev Physiol. 63, 327-357 (2001).
- Davies, P. L., Hew, C. L. Biochemistry of fish antifreeze proteins. FASEB J. 4 (8), 2460-2468 (1990).
- Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150 (Pt 1), 171-180 (2004).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. L. 59 (20), 409-418 (1991).
- Yeh, Y., Feeney, R. E. Antifreeze proteins: structures and mechanisms of function. Chem. Rev. 96 (2), 601-618 (1996).
- Smolin, N., Daggett, V. Formation of ice-like water structure on the surface of an antifreeze protein. J. Phys. Chem. B. 112 (19), 6193-6202 (2008).
- Graham, L. A., Davies, P. L. Glycine-rich antifreeze proteins from snow fleas. Science. 310 (5747), 461 (2005).
- Hawes, T. C., Marshall, C. J., Wharton, D. A. Antifreeze proteins in the Antarctic springtail, Gressittacantha terranova. J. Comp. Physiol. B. 181 (6), 713-719 (2011).
- Basu, K., Graham, L. A., Campbell, R. L., Davies, P. L. Flies expand the repertoire of protein structures that bind ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (3), 737-742 (2015).
- Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a Bacterial Antifreeze Protein as an Adhesin with Ice-Binding Activity. PLoS One. 7 (11), e48805 (2012).
- Marshall, C. B., Fletcher, G. L., Davies, P. L. Hyperactive antifreeze protein in a fish. Nature. 429 (6988), 153 (2004).
- Zhang, D. Q., Liu, B., Feng, D. R., He, Y. M., Wang, J. F. Expression, purification and antifreeze activity of carrot antifreeze protein and its mutants. Protein Expr. Purif. 35 (2), 257-263 (2007).
- Gupta, R., Dreswal, R. Low temperature stress modulated secretome analysis and purification of antifreeze protein from Hippophae rhamnoides, a Himalayan wonder plant. Proteome Res. 11 (5), 2684-2696 (2012).
- Kuiper, M. J., Lankin, C., Gauthier, S. Y., Walker, V. K., Davies, P. L. Purification of antifreeze proteins by adsorption to ice. Biochem. Biphys. Res. Commun. 300 (3), 645-648 (2003).
- Middleton, A. J., et al. Isolation and characterization of ice-binding proteins from higher plants. Methods Mol. Biol. 1166, 255-277 (2014).
- Bredow, M., Vanderbeld, B., Walker, V. K. Ice-binding proteins confer freezing tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant Biotechnol. J. , (2016).
- Olijve, L. L., et al. Blocking rapid ice crystal growth through nonbasal plane adsorption of antifreeze proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (14), 3740-3745 (2016).
- Zakharov, B., et al. Ice Recrystallization in a Solution of a Cryoprotector and Its inhibition by a Protein: Synchrotron X-Ray Diffraction Study. J. Pharm. Sci. 105 (7), 2129-2138 (2016).
- Capicciotti, C. J., et al. Small molecule ice recrystallization inhibitors enable freezing of human red blood cells with reduced glycerol concentrations. Sci. Rep. 5, 9692 (2015).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
- Van Driessche, E., Beeckmans, S., Dejaegere, R., Kanarek, L. Thiourea: the antioxidant of choice for the purification of proteins from phenol rich plant tissues. Anal. Biochem. 141 (1), 184-188 (1984).
- Marshall, C. J., Basu, K., Davies, P. L. Ice-shell purification of ice-binding proteins. Cryobiology. 72 (3), 258-263 (2016).
- Basu, K., et al. Determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185 (2014).
- Sandve, S. R., Rudi, H., Asp, T., Rognli, O. A. Tracking the evolution of a cold stress associated gene family in cold tolerant grasses. BMC Evol. Biol. 8 (245), (2008).
- Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
